懸浮細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染操作

細(xì)胞轉(zhuǎn)染前的準(zhǔn)備：

1.細(xì)胞：

貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞：一般要求在轉(zhuǎn)染前一日，必須用胰酶處理成單細(xì)胞懸液，重新接種于培養(yǎng)皿或瓶，轉(zhuǎn)染當(dāng)日的細(xì)胞密度以70%-90%（貼壁細(xì)胞），最好在轉(zhuǎn)染前2-4h換一次新鮮培養(yǎng)液。

懸浮細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前12-16h進(jìn)行懸浮細(xì)胞傳代，傳代后適宜的細(xì)胞密度為20-40x10⁴/mL。臺(tái)盼藍(lán)染色進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)保持活細(xì)胞比在95%以上。

提前將293F細(xì)胞的密度調(diào)整至合適的密度后（2×106 - 4×106細(xì)胞/ml）于37°C搖床培養(yǎng)2-4h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。注意，參與轉(zhuǎn)染的細(xì)胞必須是培養(yǎng)三代或以上的穩(wěn)定細(xì)胞株。

2.DNA：使用去內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒，于生物安全柜/超凈臺(tái)用0.22um濾頭過(guò)濾除菌。

3.稀釋液：于生物安全柜/超凈臺(tái)用0.22 μm濾頭過(guò)濾除菌。

4、轉(zhuǎn)染試劑：轉(zhuǎn)染試劑如PEI溶液長(zhǎng)期儲(chǔ)存于- 20℃，不可反復(fù)凍融，溶液在4℃放置不超過(guò)一周。

操作步驟（懸浮細(xì)胞）：

1、取一支已滅菌的Ep管，加入一定量的DNA，以相應(yīng)體積的300 mM NaCl稀釋?zhuān)脴岊^混勻后靜置5 min；

另取一支已滅菌的Ep管，加入相應(yīng)體積的300 mM NaCl稀釋對(duì)應(yīng)體積的PEI溶液用槍頭混勻后靜置5 min（稀釋液與DNA、PEI的總體積應(yīng)為轉(zhuǎn)染體積的5%）。

將質(zhì)粒和PEI溶液混合，槍頭混勻后靜置一段時(shí)間，使DNA與PEI形成穩(wěn)定的聚合物。

2、從搖床中取出293F細(xì)胞。用1 mL移液槍滴緩慢滴加轉(zhuǎn)染混合液，邊加邊搖晃搖瓶使轉(zhuǎn)染更加充分。

3、轉(zhuǎn)染后將懸浮細(xì)胞置于搖床中培養(yǎng)，條件為37℃、8%CO2、110 rpm。每隔24 h進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并用臺(tái)盼藍(lán)染色液觀(guān)察細(xì)胞的存活率。

注意事項(xiàng)：

1、DNA純度：使用去內(nèi)毒素的質(zhì)粒大提試劑盒，細(xì)菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素對(duì)細(xì)胞狀態(tài)有很大的影響。

用于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA必須無(wú)蛋白質(zhì)，無(wú)RNA和其他化學(xué)物質(zhì)的污染，確保質(zhì)粒OD值A(chǔ)260/A280在1.8~2.0之間。

提完質(zhì)粒后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證DNA的純度，通常情況下DNA為超螺旋狀態(tài)（此狀態(tài)下轉(zhuǎn)染效率更高）。

2、優(yōu)化條件

質(zhì)粒不同，所轉(zhuǎn)染的細(xì)胞不同及定量的準(zhǔn)確性等因素會(huì)導(dǎo)致在一些情況下轉(zhuǎn)染效率低，蛋白表達(dá)量低，基于這種情況需要對(duì)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑的配比、DNA的濃度、質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑的聚合時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。

3、轉(zhuǎn)染的稀釋液

研究報(bào)道，300 mM NaCl溶液稀釋DNA和轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染效率比普通培養(yǎng)基高。

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