人血漿IgG分離、純化實驗

一、實驗原理

IgG是免疫球蛋白的主要成分之一，也是動物和人體血漿的重要成分。血漿蛋白質(zhì)成分多而復(fù)雜，要從血漿中分離出IgG，首先要盡可能除去其他蛋白質(zhì)成分，使IgG在樣品中比例大為增高，然后再純化而獲得IgG。

硫酸銨沉淀法可用于從大量粗制劑中濃縮和部分純化蛋白質(zhì)。用此方法可以將主要的免疫球從樣品中分離，是免疫球蛋白分離的常用方法。高濃度的鹽離子在蛋白質(zhì)溶液中可與蛋白質(zhì)競爭水分子，從而破壞蛋白質(zhì)表面的水化膜，降低其溶解度，使之從溶液中沉淀出來。各種蛋白質(zhì)的溶解度不同，因而可利用不同濃度的鹽溶液來沉淀不同的蛋白質(zhì)。這種方法稱之為鹽析。鹽濃度通常用飽和度來表示。硫酸銨因其溶解度大，溫度系數(shù)小和不易使蛋白質(zhì)變性而應(yīng)用廣泛。DEAE-纖維素（Diethylaminoethyl-cellulose，DEAE）是在纖維素上引入二乙基氨基乙基，屬于弱堿型陰離子交換劑。吸附蛋白質(zhì)的最適pH范圍為7～9，pH超過9.5，DEAE基團(tuán)則不解離帶電荷。每克DEAE含0.96～1.24mmol/L可解離基團(tuán)，與蛋白質(zhì)的交換量可75-122mg/100mgDEAE。應(yīng)用離子交換劑來純化物質(zhì)，是把要純化的物質(zhì)成分交換吸附于離子交換劑上，然后再分別洗脫下來獲得純品，或者把不需要的成分吸附于離子交換劑上，需要的成分直接流出，得到純品。

本實驗采用DEAE-纖維素層析柱純化血清IgG，利用pH6.7的緩沖液溶解樣品IgG，此時IgG粗物中除IgG外，其他雜蛋白均帶上不同數(shù)量的負(fù)電荷，可以和DEAE上的陰離子發(fā)生交換吸附于柱上。IgG因不解離帶電，而不發(fā)生交換吸附，利用此特點，讓溶解后的樣品流過DEAE纖維素柱，即可直接收集到較純的IgG。

二、實驗方法和步驟

1.取20ml血清，加生理鹽水20ml，再逐滴加入（NH4）2SO4飽和溶液10ml，使成20%（NH4）2SO4溶液，邊加邊攪拌，充分混合后，靜置30min。

2.3000r/min離心20min，棄去沉淀，以除去纖維蛋白。

3.在上清液中再加（NH4）2SO4飽和溶液30ml，使成50%（NH4）2SO4溶液，充分混合，靜置30min。

4.3000r/min離心20min，棄上清。

5.于沉淀中加20 ml生理鹽水，使之溶解，再加（NH4）2SO4飽和溶液10 ml，使成33%（NH4）2SO4溶液，充分混合后，靜置30 min。

6.3000r/min離心20min，棄上清，以除去白蛋白。重復(fù)步驟5，2~3次。用10 ml生理鹽水溶解沉淀，裝入透析袋。

7.透析除鹽，在常水中透析過夜，再在生理鹽水中于4℃透析24 h，中間換液數(shù)次。

8.以1%BaCl2檢查透析液中的SO42-或以納氏試劑檢查NH4 （取3~4 ml透析液，加試劑1~2滴，出現(xiàn)磚紅色即認(rèn)為有NH4 存在），直至無SO42-或NH4 出現(xiàn)為止。也可采用SephadexG25或電透析除鹽。

9.離心去沉淀（去除雜蛋白），上清液即為粗提IgG （即γ球蛋白，如以36%的飽和硫酸銨沉淀血清的產(chǎn)物即為優(yōu)球蛋白，Euglobin，含γ球蛋白）。

10.過DEAE－纖維素層析柱。以0.01 mol/L pH7.4 PBS（0.03 mol/L NaCl）洗脫，收集洗脫液。也可采用SephadexG150或G200柱。

三、注意事項

1.一般不選用去離子水作為透析液，因為當(dāng)選用去離子水時，透析袋內(nèi)外達(dá)到滲透平衡時，因透析袋內(nèi)蛋白質(zhì)濃度很高，集聚了大量的負(fù)電荷，會產(chǎn)生很大的滲透壓。通常選用低濃度的緩沖液作為滲透壓。

2.透析袋在出廠時，一般使用10%甘油處理過，因此可能含有極微量的重金屬，硫化物等對蛋白質(zhì)有害的雜志。使用前可將透析袋建成10~20cm每段，在2%的碳酸氫鈉和1mmol/L的EDTA混合液中煮沸10min，并用蒸餾水全部洗凈，存放于4℃，使用前需先灌滿水，指壓檢查不漏，方可裝樣，留有三分之一至一半的空間，以防透析袋漲破。

3.透析過程中每隔2小時換一次透析液，共操作3次后，第四次更換透析液，保持過夜，第二天早上即可得到純化樣品。

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