Trizol法提取RNA：從樣本前處理到操作步驟

一、實(shí)驗(yàn)原理：

Trizol試劑的主要成分是苯酚，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解，使細(xì)胞中的蛋白質(zhì)以及核酸物質(zhì)解聚。苯酚雖然可以有效的使蛋白質(zhì)變性，但它不能全部抑制RNA酶的活性，因此Trizol中還加入了8-羥基喹啉、異硫氰酸胍、β-巰基乙醇等來抑制內(nèi)源和外源RNase（即RNA酶）。存放在Trizol 中的樣品可以在負(fù)八十保存半年左右。

二、樣本材料及其處理方法：

貼壁培養(yǎng)細(xì)胞

1.吸出培養(yǎng)液，細(xì)胞用預(yù)冷的1×PBS清洗兩次。2. 吸出PBS洗液，然后每1×108-2×107的培養(yǎng)細(xì)胞中加入1 ml的Trizol，輕搖培養(yǎng)皿，確保溶液均勻分布于細(xì)胞表面。（可用細(xì)胞刮刀剝離細(xì)胞）

2.吸出PBS洗液，然后每1×108-2×107的培養(yǎng)細(xì)胞中加入1 ml的Trizol，輕搖培養(yǎng)皿，確保溶液均勻分布于細(xì)胞表面。（可用細(xì)胞刮刀剝離細(xì)胞）

3. 使用移液器反復(fù)吹打使細(xì)胞脫落，然后將內(nèi)含細(xì)胞的裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，再用移液器吹打直至裂解液中無(wú)明顯沉淀（溶液清亮）。

4. 室溫靜置5-10分鐘后，再進(jìn)行后續(xù)的RNA提取操作。

懸浮培養(yǎng)細(xì)胞

1. 將懸浮細(xì)胞收集至離心管中，12000 rpm 4℃離心2分鐘，棄上清，用預(yù)冷的1×PBS清洗兩次。

2. 向1×106-2×107細(xì)胞中加入1ml的Trizol。

3. 用移液器吹打至裂解液清亮無(wú)明顯沉淀。

4. 室溫靜置5-10分鐘后，再進(jìn)行后續(xù)的RNA提取操作。

動(dòng)物組織、植物材料樣品

1. 將準(zhǔn)確稱取的RNA提取樣品轉(zhuǎn)移液氮預(yù)冷的研缽中，用研杵研磨組織（研磨過程中需要不斷向研缽中補(bǔ)加液氮），直至研磨成粉末狀，然后向粉末中加入適量的Trizol并混勻。（針對(duì)柔軟易裂解的組織樣本，可以使用勻漿器加入適量Trizol進(jìn)行勻漿裂解。）

2. 將上述混合液轉(zhuǎn)移至離心管中，用移液器反復(fù)吹打充分混勻。室溫靜置5分鐘，12,000 rpm 4℃離心5-10分鐘。

3. 小心吸取上清液，移入新的離心管中，再進(jìn)行后續(xù)的RNA提取操作。

三、操作步驟：

（1）樣本前處理。

（2）向上述裂解液中加入Trizol體積量1/5氯仿，充分混合（渦旋或用槍頭混勻）。室溫靜置15分鐘。

（3）12000 rpm 4℃離心15分鐘。小心取出離心管，此時(shí)勻漿液分為三層，即：上清液（含RNA）、中間蛋白層及下層有機(jī)相。吸取上清液轉(zhuǎn)移至另新的離心管中。

注：每管大概取 200-300 μl，此步驟非常關(guān)鍵，提出的RNA質(zhì)量好純度高即可。若吸取水相時(shí)吸到有機(jī)相會(huì)導(dǎo)致雙峰，A260/230特別低。

（4）沉淀 RNA：向其中加入相同體積異丙醇，上下顛倒混勻。在-20℃放置10 min。12000 rpm 4℃離心10 min后棄去上清。

（5）清洗 RNA：向沉淀中加入500 μl 預(yù)冷的無(wú)水乙醇，吹散沉淀洗滌RNA，洗滌兩次，12000 rpm 4℃離心后棄去上清。

注：把沉淀彈起來，讓其懸浮在酒精中，然后放1-2min，讓酒精充分接觸沉淀，充分溶解有機(jī)試劑，然后再離心。

（6）打開離心管，室溫干燥沉淀約5分鐘。

注：不要離心干燥，否則RNA將很難溶解，如果殘留乙醇較多可延長(zhǎng)干燥時(shí)間。

（7）向離心管中加入20 μl DPEC水溶解RNA。將溶解后的RNA放入-80℃保存。

注：如果提取的是組織樣本，溶解液可以多加點(diǎn)。

（8）取2 μl進(jìn)行電泳。

四、注意事項(xiàng)：

1. 防止RNA酶污染。

• 戴好口罩，手套。
• 全程最好在生物安全柜操作（根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件）
• 實(shí)驗(yàn)所涉及的試劑/溶液，尤其是水，必須確保RNase-Free。耗材均需要通過DPEC處理。

2. 明確目標(biāo)。

• 提取成功標(biāo)準(zhǔn)是RNA的質(zhì)量和純度，而不是得率。

3. 測(cè)量結(jié)果：

• A260/A280：1.8-2.2，若<1.8則表明有蛋白質(zhì)污染；

• A260/A230：1.5-2.4，若<1.5則表明有明顯的有機(jī)物如糖、膚、苯酚的污染。

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