鐵死亡預(yù)測(cè)物被揭示，或可成性標(biāo)志為惡性腫瘤的新治療靶點(diǎn)

骨肉瘤（OS）是骨骼系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，約占所有骨瘤的56%。OS起源于惡性間充質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的類骨或未成熟骨，因此通常影響兒童和青少年。由于其惡性程度高、轉(zhuǎn)移早、易復(fù)發(fā)、耐藥等特點(diǎn)，其死亡率高，預(yù)后差。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，誘導(dǎo)非凋亡細(xì)胞死亡是一種新型抗腫瘤策略，能用來(lái)克服現(xiàn)有的腫瘤耐藥問題。鐵死亡是一種新發(fā)現(xiàn)的程序性細(xì)胞死亡形式，具有多種形態(tài)特征、誘導(dǎo)因子和調(diào)節(jié)機(jī)制。因此，靶向調(diào)控腫瘤細(xì)胞鐵死亡可能是治療腫瘤較有前景的方法。目前已證實(shí)在肝細(xì)胞癌、乳腺癌、黑色素瘤、卵巢癌和腎癌等不同類型的癌癥中，鐵死亡在限制癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增強(qiáng)細(xì)胞殺傷和克服耐藥性方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。然而，不同腫瘤細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性是高度異質(zhì)性的，因此需要進(jìn)一步深入了解調(diào)控整個(gè)過程的分子機(jī)制。

最新研究發(fā)現(xiàn)，鐵死亡抑制蛋白1( Ferroptosis suppressor protein 1, FSP1)  能夠減少脂質(zhì)過氧化物，從而抑制鐵死亡。值得關(guān)注的是，抑制 FSP1 可選擇性地使癌細(xì)胞對(duì)鐵死亡變得敏感，從而突出了其可作為潛在生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

2024年2月17日，來(lái)自意大利東皮埃蒙特大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)在Cell Death Discovery雜志發(fā)表了題為FSP1 is a predictive biomarker of osteosarcoma cells susceptibility to ferroptotic cell death and a potential therapeutic target 的文章，在這項(xiàng)研究中，他們發(fā)現(xiàn)OS細(xì)胞的異質(zhì)性細(xì)胞反應(yīng)和對(duì)鐵死亡的敏感性與 FSP1 的基礎(chǔ)表達(dá)直接相關(guān)，抑制 FSP1 的表達(dá)或活性可以有效地使耐藥 OS 細(xì)胞對(duì)鐵死亡重新敏感。此外，他們還揭示了調(diào)節(jié) OS 細(xì)胞中 FSP1 基礎(chǔ)表達(dá)的分子機(jī)制，從而表明 FSP1 是一種新的有價(jià)值的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物，可以預(yù)測(cè) OS 對(duì)鐵死亡的敏感性，并有可能成為一種新的治療靶點(diǎn)。

1. OS 對(duì)鐵死亡的敏感性具有異質(zhì)性

根據(jù)腫瘤類型、微環(huán)境和獲得性突變，癌細(xì)胞對(duì)鐵死亡具有異質(zhì)性的敏感性，使每個(gè)腫瘤成為一個(gè)奇特的實(shí)體，增加了確定正確治療方案的難度。因此，為了評(píng)估人骨肉瘤對(duì)鐵死亡的敏感性，他們?cè)u(píng)估了 3 個(gè)人骨肉瘤細(xì)胞系 U2OS、MG63 和 HOS 中這種非凋亡細(xì)胞死亡過程的誘導(dǎo)和執(zhí)行。

將 3 株細(xì)胞系經(jīng) 0.5µM RSL3 處理，8 小時(shí)后通過 qPCR 檢測(cè)已知鐵離子標(biāo)記物 PTGS2 和 SLC7A11 的表達(dá)情況。結(jié)果表明，與未處理對(duì)照組相比，RSL3 處理細(xì)胞中 PTGS2 和 SLC7A11 均顯著上調(diào)，脂質(zhì) ROS 在 HOS 中大量積累，在 MG63 中略少，在 U2OS 中明顯降低。有趣的是，在三種細(xì)胞系中，鐵細(xì)胞死亡的執(zhí)行有顯著差異，具體表現(xiàn)為：在 RSL3 的作用下，HOS 細(xì)胞的活力顯著下降，為 17%，MG63 對(duì)處理也很敏感，細(xì)胞活力下降到 34%，而 U2OS 細(xì)胞對(duì)處理無(wú)反應(yīng)  (細(xì)胞活力為 93%)?？偟膩?lái)說，這些結(jié)果清楚地表明，U2OS 對(duì)鐵死亡最耐藥，而 HOS 對(duì)鐵死亡最敏感。

2. 骨肉瘤的 EMT 和鐵離子敏感性

上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化  (Epithelial-to-mesenchymal transition, EMT) 是骨肉瘤從原發(fā)部位脫離并獲得侵襲性和轉(zhuǎn)移性表型的重要機(jī)制。此外，一些證據(jù)表明，化療耐藥或接受 EMT 的癌細(xì)胞可能對(duì)鐵死亡表現(xiàn)出更大的脆弱性。

他們?cè)谌N骨肉瘤細(xì)胞系  (U2OS、MG63 和 HOS) 中檢測(cè)了 EMT 標(biāo)記物的表達(dá)，包括轉(zhuǎn)錄因子 TWIST1 和 SNAIL、細(xì)胞粘附分子 N-Cadherin (N-Cad) 和 E-cadherin (E-Cad)、基質(zhì)金屬蛋白酶 9 (MMP9) 和中間絲蛋白 Vimentin (VIM) 的表達(dá)。除 E-Cad 外，EMT 標(biāo)記物在鐵死亡敏感的 HOS 細(xì)胞株中表達(dá)明顯增強(qiáng)，上皮標(biāo)記物 E-Cad 在最耐藥的 U2OS 中表達(dá)最高，而在 MG63 和 HOS 中表達(dá)程度較低。

他們還通過 Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)評(píng)估了細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)果表明，HOS 細(xì)胞的侵襲性高于 MG63 和 U2OS，而 U2OS 的侵襲性較小?？偟膩?lái)說，這些數(shù)據(jù)清楚地表明 EMT 與骨肉瘤細(xì)胞的鐵死亡之間存在相關(guān)性。

3. FSP1 在 OS 抵抗鐵死亡誘導(dǎo)中起關(guān)鍵作用

鐵死亡抑制蛋白 1 (FSP1)，也被稱為細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子線粒體 2 (AIFM2)，是一種新近發(fā)現(xiàn)的鐵死亡抑制因子，它與 GPX4 共同工作，但獨(dú)立于 GPX4。因此，為了研究 FSP1 在 OS 細(xì)胞鐵死亡中的潛在作用，他們首先評(píng)估了其基礎(chǔ)表達(dá)水平。數(shù)據(jù)顯示，U2OS 細(xì)胞的 FSP1 mRNA 表達(dá)量最高，HOS 細(xì)胞的 FSP1 mRNA 表達(dá)量最小，MG63 細(xì)胞的 FSP1 mRNA 表達(dá)量居中。這些結(jié)果提出了一種假設(shè)，即 FSP1 的基礎(chǔ)表達(dá)可能被用作 OS 對(duì)鐵死亡執(zhí)行敏感性的潛在預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物。

數(shù)據(jù)顯示 RSL3 刺激的 FSP1 上調(diào)在最耐藥的 U2OS 中尤為明顯，而在 MG63 中不那么明顯，在最敏感的 HOS 中更溫和，這進(jìn)一步證實(shí)了 FSP1 可能參與 OS 細(xì)胞對(duì)鐵死亡的耐藥性。

為了驗(yàn)證我們的假設(shè)，他們使用特異性抑制劑 iFSP1(6µM) 抑制 FSP1 的活性，并將所有 OS 細(xì)胞株暴露在 0.5µM RSL3 環(huán)境下 24 小時(shí)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有 OS 細(xì)胞株對(duì)鐵死亡的敏感性增強(qiáng)。重要的是，F(xiàn)SP1 抑制恢復(fù)了耐藥 U2OS 細(xì)胞的表型，使這些細(xì)胞對(duì)鐵死亡高度敏感。

此外，他們也在 3D OS 球體中評(píng)估了 OS 細(xì)胞對(duì) RSL3 誘導(dǎo)的鐵死亡敏感性。與 2D 細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果一致，3D 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明：HOS 細(xì)胞比 MG63 更敏感，并且 FSP1 抑制持續(xù)增加了兩種細(xì)胞類型對(duì) RSL3 處理的敏感性。

4. NRF2 在 OS 細(xì)胞中不調(diào)控 FSP1 的表達(dá)

為了檢測(cè) NRF2 是否參與了 FSP1 的基礎(chǔ)表達(dá)調(diào)控，他們?cè)诠侨饬黾?xì)胞系中評(píng)估了該轉(zhuǎn)錄因子的蛋白和 mRNA 水平。研究發(fā)現(xiàn)，在 U2OS 中 NRF2 的表達(dá)與 HOS 中非常相似，而在 MG63 中 NRF2 的表達(dá)在蛋白水平和 mRNA 水平上都略高。在評(píng)估 NRF2 負(fù)調(diào)控因子 KEAP1 的表達(dá)時(shí)也得到了類似的結(jié)果。這些結(jié)果表明了 NRF2 可能不參與 FSP1 基礎(chǔ)表達(dá)的調(diào)節(jié)。

不過，NRF2 在鐵死亡過程中的作用已被描述，該因子參與鐵死亡的氧化應(yīng)激所引起的一般抗氧化靶基因的調(diào)控，以及鐵誘導(dǎo)特異性因子的調(diào)控。因此，為了驗(yàn)證 NRF2 信號(hào)通路的完整性及其在鐵離子刺激下的迅速激活，他們?cè)u(píng)估了氧化應(yīng)激相關(guān) HO-1 和 NQO1 以及鐵離子相關(guān) GPX4 和 SLC7A11 的表達(dá)。整體數(shù)據(jù)表明，NRF2 在鐵死亡早期被激活，但不參與 FSP1 的基礎(chǔ)表達(dá)。

5. p53 在 OS 細(xì)胞中參與調(diào)節(jié) FSP1 的基礎(chǔ)表達(dá)

接下來(lái)，他們?cè)?nbsp;p53 缺失的 MG63 細(xì)胞中短暫過表達(dá)野生型 p53，并評(píng)估 FSP1 的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MG63 細(xì)胞中野生型 p53 的 FSP1 基因表達(dá)量呈劑量依賴性增加。后續(xù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，抑制 p53 的表達(dá)可以降低 FSP1 的基礎(chǔ)表達(dá)，說明 p53 在骨肉瘤細(xì)胞中參與調(diào)控 FSP1 的基礎(chǔ)表達(dá)。

結(jié)語(yǔ)

綜上所述，他們基于最近描述的一種新的程序性細(xì)胞死亡形式，即鐵死亡，探索了一種潛在的殺死骨肉瘤細(xì)胞的策略，它的特征是鐵依賴的脂質(zhì)過氧化物（非凋亡細(xì)胞死亡的執(zhí)行者），為傳統(tǒng)療法抵抗的癌癥提供了新的治療機(jī)會(huì)。