Trizol法和柱式法RNA提取的實驗流程和注意事項

實驗原理：

（一）Trizol 法

Trizol是一種酸性試劑，能從細胞和組織中快速分離RNA，其主要成分為異硫氰酸胍（GITC）和苯酚。裂解細胞后，GITC能使蛋白質(zhì)和RNase變性，有利于保護RNA的完整性；加入氯仿離心后，樣品分為水相和有機相，RNA存在于上層水相中，而DNA和蛋白質(zhì)則存在于中間層及下層有機相中，從而達到分離的目的。簡單來講就是裂解細胞使RNA得以釋放，加之有機溶劑使RNA與DNA、蛋白質(zhì)分離，并進一步純化得到RNA的過程。

試劑、儀器與耗材：

Trizol試劑、氯仿、異丙醇、75%乙醇、RNase free Water、低溫冷凍離心機、勻漿器或組織研磨器、渦旋振蕩器、金屬浴、微量移液器、通風(fēng)櫥、計時器、1.5ml EP管等。

提取步驟：

1.樣品處理：

細胞：貼壁細胞每106細胞加入1ml裂解液，吹打混勻。

懸浮細胞：植物、動物、酵母每10^6細胞加入1ml裂解液。

細菌細胞每107細胞加入1ml裂解液混勻。

組織：新鮮或-70℃凍存100mg組織加1ml裂解液，勻漿處理。

2.室溫放置5min，使核酸蛋白復(fù)合物全部分離；

3.向勻漿樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋好管蓋，劇烈振蕩15s，室溫放置3-5min；

4.2-8℃，12000rpm離心10min。RNA主要存在于上層水相中把水相轉(zhuǎn)移至新的EP管中（注：不可吸到沉淀）；

5.吸附柱前處理：在吸附柱中加入500ul洗柱液，室溫放置2min，2-8℃，12000rpm離心2min，棄廢液（小Tips：此步可以在第四步離心還剩2min左右的時候進行，這樣第四步離心結(jié)束就可以直接進行洗柱，而不需要再等時間）；

6.在收集的上清中加入200ul無水乙醇混勻，加入吸附柱中靜置2min，2-8℃，12000rpm離心2min，棄廢液；

7.向吸附柱中加入600ul漂洗液（注：新買的試劑盒中漂洗液還需要加入一定量的無水乙醇，此步一定要確認漂洗液是否加入無水乙醇），2-8℃，12000rpm離心2min，棄廢液；

8.向吸附柱中加入600ul漂洗液，2-8℃，12000rpm離心2min，棄廢液（注：漂洗液在7-8步共加了兩次哦）；

9.12000rpm離心2min，棄掉收集管，將吸附柱置于室溫數(shù)分鐘（10-15min）以去除殘留的漂洗液（注：最好在通風(fēng)櫥進行，以免RNA酶對RNA的降解；通風(fēng)櫥在使用前也可先紫外30min）；

10.將吸附柱放入新管中，向膜中央滴加50-100ul RNase free ddH2O（通常取中間值），室溫放置5min，12000rpm室溫離心2min即可得到RNA溶液（注：所有步驟中僅最后一步離心是在室溫，其余均在2-8℃，因此，前幾步離心拿出樣品后一定要及時關(guān)上離心機蓋子，以免升溫，而在第9步離心結(jié)束后就可以打開離心機蓋子使其快速升至室溫）。

四、 注意事項

1．佩戴手套、口罩，消毒操作臺，杜絕外源酶的污染；

2．所用試劑耗材必須無酶化，有條件者可以直接購買，否則就要做好高壓滅菌的工作；

3．得到RNA溶液后可保存于-80℃，避免反復(fù)凍融，放置時間不可過長；

4．對于組織RNA的提取，一定要充分勻漿處理以使RNA充分釋放出來。

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