THP-1細胞的培養(yǎng)方法和注意事項

簡介：

THP-1細胞是從急性單核細胞白血病患者外周血中分離出來的單核細胞，廣泛應用于單核細胞和巨噬細胞相關機制、信號通路等研究；形態(tài)和分化特性類似于原代單核細胞和巨噬細胞，在體外，常用PMA（phorbol 12-肉豆酸酯13-乙酸酯）或1α，25(OH)2D3 (1α，25-二羥基維生素D3或vD3)誘導分化THP-1細胞為巨噬細胞。因此，THP-1單核細胞已被開發(fā)為體外極化單核細胞來源的巨噬細胞的有吸引力的模型。

原理：

一、THP-1細胞的培養(yǎng)方法

1.細胞復蘇

準備工作：15/50mL的離心管，馬克筆，培養(yǎng)瓶（T25）/培養(yǎng)皿（直徑60mm），RPMI 1640培養(yǎng)基，胎牛血清（FBS），雙抗（PS），酒精瓶（消毒殺菌）+酒精棉球，離心管/試劑管架子，移液槍，tip頭（1000/200ul）。

（1）首先用酒精棉球擦拭細胞房的實驗臺子，將我們所需要上述物品放入臺子里，并用紫外照30min，此時打開水浴鍋42℃。

（2）照完紫外后，將保存在-80℃或者液氮中的細胞拿出用一次手套包住并迅速放入42℃水浴鍋中，一般在1min中內(nèi)解凍。

（3）通過傳遞箱將細胞拿進細胞房，打開照明，打開細胞臺子的玻璃門，用酒精噴灑手和細胞凍存管將細胞拿進臺子里，進行細胞復蘇。

（4）配置培養(yǎng)基：以50ml離心管為例：RPMI 1640培養(yǎng)基+10% 胎牛血清+ 1%雙抗：500ul雙抗（PS）+5mL(10%)/7.5(15%)胎牛血清（FBS）+RPMI 1640培養(yǎng)基加至50mL，并做好標記（培養(yǎng)基成分+配置時間+個人標記（名字））。

（5）首先準備一只15ml離心管，將細胞凍存管內(nèi)的細胞以及凍存液吸取至離心管中，加入2mL 步驟（4）中配置好的RPMI 1640培養(yǎng)基，700~800rpm ，低速離心5min。

（6）離心的時間，準備T25培養(yǎng)瓶或者直徑60mm的培養(yǎng)皿做好標記（細胞名稱+復蘇時間+姓名）。離心完成后，棄上清，吸取1ml（血清）細胞培養(yǎng)基重懸細胞。

（7）吸取2-3ml新鮮培養(yǎng)基至準備好培養(yǎng)瓶或者培養(yǎng)皿中，再將1ml細胞重懸液吸取至T25瓶或培養(yǎng)皿，“十字"搖勻細胞。

（8）用酒精噴灑后，將細胞放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3天觀察細胞狀態(tài)。

注意：細胞在偏酸性環(huán)境中生長更快，當培養(yǎng)基稍微變黃（呈橘紅色）時，比較適合細胞生長。

2、細胞傳代

THP-1細胞為懸浮細胞且具有低密度依賴性，一般超過10^6/ml傳代，比例一般為1:3/1:4，因此目前利用的兩種傳代方式：

(1)半換液傳代（不用離心）:吸取培養(yǎng)瓶或者培養(yǎng)皿中的細胞移至新的培養(yǎng)瓶或者培養(yǎng)皿中，補足培養(yǎng)基2-3ml。

(2)傳統(tǒng)的離心傳代：將瓶子或皿中的細胞吸取至15mL離心管中，700-800rpm，離心5min；棄上清，吸取2-3ml新鮮培養(yǎng)基重懸細胞，分至新的培養(yǎng)瓶或者培養(yǎng)皿中并補足培養(yǎng)基2-3ml。

3、細胞凍存

（1）用10%DMSO：900ul FBS + 100ul DMSO （有毒小心操作）或直接用無血清細胞凍存液。

（2）收集生長狀態(tài)較好的細胞于15 mL離心管中，一般細胞數(shù)目為5×10^6-10^7/ml，700-800 rpm離心5 min，在超凈工作臺中用槍頭盡量去掉上清。

（3）加入1 mL凍存液，輕輕吹勻。將細胞放入梯度降溫盒中，放入-80℃培養(yǎng)箱中幾天后，轉(zhuǎn)移至液氮中進行長期保存。

注意事項或培養(yǎng)方面的經(jīng)驗心得

（1）THP-1細胞凍存后復蘇困難，因此要保證凍存的細胞數(shù)目足夠5×10^5-10^6個cell/ml；否則細胞密度過低，復蘇后狀態(tài)不好。

（2）培養(yǎng)過程中如果存在細胞碎片，可等待細胞長起來后，通過低速離心去除。

（3）細胞發(fā)生少量聚團時我們可以等待THP-1細胞密度擴大后改善這種情況，但發(fā)生嚴重聚團時我們可以提高血清（FBS）用量，或者適度吹散細胞。

（4）THP-1細胞在傳代后可能會出現(xiàn)貼壁現(xiàn)象，如輕微貼壁可以輕 吹收集細胞或者丟棄貼壁的細胞，貼壁較多時，可檢查培養(yǎng)條件是否合適。

THP-1細胞培養(yǎng)過程中復蘇困難、聚團問題分析

1、復蘇困難

THP-1細胞對細胞密度具有高度依賴性。凍存時，密度一般為5×10^6-10^7/ml較為適宜；同時復蘇密度也有依賴性，建議不低于3×10^6/ml。當細胞傳過幾次代，狀態(tài)較好時，傳代密度維持在5×10^/ml-10^6/ml較為合適，超過2×10^6/ml可進行傳代。培養(yǎng)過程中如有細胞碎片，等細胞密度增大后可以通過低速離心去除。

2、細胞聚團嚴重

細胞聚團可能是細胞營養(yǎng)缺失或者受到損傷，所以共用了細胞膜，以便于彼此釋放的促進生長的因子可以被很快接收到，細胞生長一段時間后，可吹打開，離心，然后換液。另外，THP1細胞離心速度一般不要高于800rpm，實驗室常用600-700rpm，否則可能會導致細胞死亡。

（1）THP-1細胞在密度較稀時，有少量細胞聚團屬于正?，F(xiàn)象，我們需使用面積小的培養(yǎng)瓶（T25瓶）或者培養(yǎng)皿（直徑60mm），培養(yǎng)基用量也相應減少，不建議將聚團的細胞吹散，等待密度高時，細胞會自然分散開。

（2）當細胞密度高時，聚團細胞比例高于30%時，聚團嚴重。細胞間界線不清晰，細胞團模糊且較大等現(xiàn)象，則這種細胞聚團是異常的。此時，若對細胞沒有做過任何外界刺激或?qū)嶒炋幚?，可檢查培養(yǎng)條件，一般更換優(yōu)質(zhì)血清或提高血清用量看是否有助于解決聚團問題。

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