Dot blot法鑒定分泌型蛋白表達(dá)

實(shí)驗(yàn)原理：

Dot blot是一種半定量的蛋白質(zhì)或核酸檢測(cè)方法，其原理是將待測(cè)物直接滴于固相載體上，然后通過特異性抗體或探針與待測(cè)物結(jié)合，最終通過可視化方法來(lái)檢測(cè)目標(biāo)分子的存在與否。

溶液配置：

操作步驟：

（1）減取適當(dāng)大小的PVDF膜，于甲醇活化1分鐘；

（2）將活化后的PVDF膜于ddH2O中，在脫色搖床上清洗15分鐘；

（3）提取預(yù)冷離心機(jī)，將樣品在4℃低溫條件下8000 rpm離心15分鐘，取上清作為樣品（分泌型蛋白）。

（4）取出活化后的PVDF膜在室溫晾至半干，看見水膜消失即可。將收集的上清、空白對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照分別取5ul點(diǎn)樣至PVDF膜上，風(fēng)干。室溫待樣品吸收，樣品吸收后點(diǎn)樣處顏色加深。

（5）封閉：待PVDF膜上樣品干燥后，于含5%脫脂奶粉的TBST溶液中封閉，37℃培養(yǎng)箱孵育2h或者4℃過夜孵育。

（6）TBST清洗PVDF膜5次，每次5分鐘。

（7）一抗孵育：用含5%脫脂奶粉的TBST溶液以1：10000的稀釋比稀釋一抗，37℃培養(yǎng)箱孵育2h或4℃過夜孵育。

（8）TBST清洗PVDF膜5次，每次5分鐘。

（9）二抗孵育：用含5%脫脂奶粉的TBST溶液以1：10000的稀釋比稀釋二抗，37℃培養(yǎng)箱孵育1.5 h。

（10）TBST清洗PVDF膜5次，每次5分鐘。

（11）曝光：用濾紙吸干PVDF膜上的TBST溶液，滴加ECL超敏顯色劑（A液：B液=1：1），提前將化學(xué)曝光儀預(yù)冷，進(jìn)行曝光，觀察并記錄結(jié)果。

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