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    神奇的生物素biotin

    發(fā)布時(shí)間： 2024-03-26　　點(diǎn)擊次數(shù)： 881次

    1. 什么是生物素？

    物素分子量為244.31，分子中有兩個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其中I環(huán)為咪唑酮環(huán)，是與親合素結(jié)合的主要部位；II環(huán)為噻唑環(huán)，上有一戊酸側(cè)鏈，其末端羧基是結(jié)合抗體和其他生物大分子的結(jié)構(gòu)。利用生物素的羧基加以化學(xué)修飾可制成各種活性基團(tuán)的衍生物，稱為活化生物素，同時(shí)可根據(jù)特殊的用途對(duì)這些試劑的化學(xué)性質(zhì)（溶解性、臂長(zhǎng)、可剪切與否）進(jìn)行優(yōu)化，以適合與各種生物大分子結(jié)合的需要。

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                                                                  生物素

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    2. 什么是生物素化？

    生物素化是指將化學(xué)物質(zhì)或分子與生物素（biotin）結(jié)合在一起的過程。生物素是一種水溶性的維生素，也被稱為維生素B7或維生素H，它在許多生物體的生物化學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用。生物素可以通過化學(xué)合成或從天然來(lái)源（如食物中）獲得。生物素化通常在生物實(shí)驗(yàn)室中用于標(biāo)記和檢測(cè)特定的分子或蛋白質(zhì)，其中生物素與待檢測(cè)的分子或蛋白質(zhì)結(jié)合，然后可以通過生物素與其他分子之間的特異性相互作用來(lái)檢測(cè)或純化目標(biāo)分子。


    3. 什么是生物素-鏈霉親和素（SA-Biotin）系統(tǒng)？

    Streptavidin是一種具有四個(gè)相同結(jié)合位點(diǎn)的蛋白質(zhì)，它能夠與生物素結(jié)合形成非常緊密的復(fù)合物，也是已知的非共價(jià)相互作用之一（解離常數(shù) (Kd) 約為 10x-15 mol/L）。生物素和Streptavidin之間的鍵形成非常迅速，一旦形成，它不受pH值、溫度、有機(jī)溶劑和其他變質(zhì)劑的影響。生物素與Streptavidin之間的結(jié)合非常特異，因?yàn)樗鼈冎g存在著高度親和力。這種親和力使得生物素-Streptavidin復(fù)合物成為一種非常有用的工具，用于檢測(cè)、分離和純化許多生物分子，例如蛋白質(zhì)、DNA或RNA。生物素與Streptavidin互作通常被用于許多生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的標(biāo)記和純化技術(shù)，這種相互作用也被廣泛用于結(jié)合生物分子（如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸）、合成分子（如熒光標(biāo)記）、生物芯片技術(shù)、免疫組化、Western blot分析和其他分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中。

    生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是能夠提高檢測(cè)靈敏度。這在很大程度上是由于鏈霉親和素的四聚體構(gòu)象。一種鏈霉親和素蛋白能夠以高親和力和選擇性結(jié)合四種生物素分子。這種多樣性能夠放大弱信號(hào)，并通過簡(jiǎn)單的工作流程提高哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織中中低豐度目標(biāo)的檢測(cè)靈敏度。另一個(gè)關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)是生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)的多功能性。因?yàn)殒溍褂H和素可以與多種報(bào)告標(biāo)簽結(jié)合，所以它可以很容易地結(jié)合到幾乎所有的免疫測(cè)定中。例如，鏈霉親和素的酶偶聯(lián)物廣泛用于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA)，而熒光標(biāo)記的鏈霉親和素，如iFluor 488鏈霉親和素，則廣泛用于細(xì)胞表面標(biāo)記、熒光細(xì)胞分選 (FACS) 和其他熒光檢測(cè)成像應(yīng)用。

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    鏈霉親和素-生物素標(biāo)記抗體相互作用的圖示

    4. 生物素標(biāo)簽的應(yīng)用

    在許多蛋白質(zhì)研究應(yīng)用中，生物素標(biāo)記（即生物素化）的蛋白質(zhì)常規(guī)用Streptavidin結(jié)合物檢測(cè)或純化，包括

    1. 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA)

    2. 免疫組織化學(xué) (IHC)

    3. Power Styramide 信號(hào)放大，是酪胺的替代品

    4. 免疫印跡

    5. 免疫熒光顯微鏡

    6. 細(xì)胞表面標(biāo)記

    7. 親和純化

    8. 熒光細(xì)胞分選 (FACS)

    9. 流式細(xì)胞術(shù)

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    Dynabeads 鏈霉親和素相關(guān)磁珠的應(yīng)用

    5. 生物素標(biāo)記的大致流程：

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    • 待標(biāo)記物的蛋白濃度不能過低，如若濃度過低需經(jīng)超濾濃縮等手段提高濃度至0.1mg/mL以上。
    • 一個(gè)蛋白質(zhì)可能被多個(gè)生物素標(biāo)記，標(biāo)記時(shí)，生物素與待標(biāo)記物應(yīng)有合適的比例，確保標(biāo)記后不影響待標(biāo)記物的活性。推薦生物素：抗原蛋白比例為1~3：1，生物素：抗體比例為5~20：1或根據(jù)標(biāo)記試劑盒說(shuō)明書推薦比例。
    • 為減少空間位阻影響，基于檢測(cè)靈敏度特異性等要求，可在生物素與被標(biāo)記物之間加入交聯(lián)臂結(jié)構(gòu)。
    • 如果偶聯(lián)基團(tuán)為氨基，待標(biāo)記物的系統(tǒng)不得含有游離的氨基（Tris,氨基酸）、載體蛋白（BSA）或者其他干擾物，若有干擾物需要用標(biāo)記緩沖液反復(fù)超濾確保其去除干凈，若采用其他基團(tuán)偶聯(lián)試劑，待標(biāo)記物系統(tǒng)亦不能有含對(duì)應(yīng)的游離基團(tuán)的物質(zhì)。
    • 如果待標(biāo)記物為分子量較小的物質(zhì)，在純化過程中注意超濾管、脫鹽柱、透析袋的截留分子量。
    • 標(biāo)記反應(yīng)后的體積量至少在100μL以上，以達(dá)到純化時(shí)的最小上樣量。
    • 標(biāo)記反應(yīng)完成后（氨基偶聯(lián)體系），可在體系中加入適量的含游離含氨基小分子物質(zhì)，中和游離的生物素活化試劑，提高純化效率，減少后續(xù)反應(yīng)的假陽(yáng)性和高背景。
    • 純化后的標(biāo)記蛋白可采用A280或BCA法測(cè)定蛋白含量。
    • 標(biāo)記純化后的蛋白可根據(jù)蛋白性質(zhì)進(jìn)行分裝長(zhǎng)期保存，減少凍融次數(shù)。
    蛋白互作中利用臨近連接法用生物素標(biāo)記互作蛋白
    可通過生物素連接酶(Biotin-protein ligase, BirA)對(duì)Avi標(biāo)簽融合蛋白或多肽快捷、高效地進(jìn)行生物素標(biāo)記。生物素標(biāo)記的蛋白可使用基于Streptavidin或Avidin方法進(jìn)行純化或檢測(cè)，例如使用Streptavidin磁珠對(duì)生物素標(biāo)記蛋白進(jìn)行純化，或用HRP等標(biāo)記的Streptavidin對(duì)生物素標(biāo)記蛋白進(jìn)行檢測(cè)。Avi標(biāo)簽是由15個(gè)氨基酸(GLNDIFEAQKIEWHE)組成的短肽標(biāo)簽，在ATP和生物素存在的條件下，BirA在Avi標(biāo)簽的賴氨酸殘基上連接一個(gè)生物素，從而實(shí)現(xiàn)目的蛋白的生物素標(biāo)記。
    生物素連接酶BirA特異性的生物素標(biāo)記Avi標(biāo)簽有多方面的優(yōu)點(diǎn)。Avi標(biāo)簽小且對(duì)融合蛋白的影響非常小，只針對(duì)Avi標(biāo)簽上的Lys殘基進(jìn)行特定位置的生物素標(biāo)記，生物素標(biāo)記效率高，可重復(fù)性好；體內(nèi)或體外均可進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記后的蛋白與鏈霉親和素(Streptavidin)的親和力高，從而使Avi-tag技術(shù)可以應(yīng)用于目的蛋白的固定吸附、純化和檢測(cè)等；相比于傳統(tǒng)生物素化學(xué)標(biāo)記的非特異性位點(diǎn)的標(biāo)記，BirA催化的反應(yīng)條件更溫和、更簡(jiǎn)單，對(duì)被標(biāo)記蛋白活力影響小，酶活效率高，標(biāo)記特異性強(qiáng)。

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    6. 生物素化核苷酸及oligo

    生物素修飾的三磷酸核苷類似物，如 dUTP 和 dCTP，可以通過酶促整合到 DNA 或 RNA 片段中，用于熒光原位雜交 (FISH)、DNA 陣列、微陣列和其他雜交技術(shù)。標(biāo)準(zhǔn)酶促非放射性DNA標(biāo)記反應(yīng)，包括3'末端標(biāo)記、cDNA 標(biāo)記、切口平移、PCR和隨機(jī)引物標(biāo)記。每個(gè)生物素化核苷酸在生物素與其在核苷酸上的連接點(diǎn)之間包含一個(gè) 11、14、16 或 20 個(gè)原子的間隔區(qū)。例如常見的Biotin-dATP或Biotin-dCTP被用于HiC實(shí)驗(yàn)添加到酶切口處；生物素標(biāo)記的linker(21bp dsDNA)可用于ChIAPET實(shí)驗(yàn)中連接兩個(gè)染色質(zhì)DNA片段；在RNA pull down實(shí)驗(yàn)中用生物素標(biāo)記RNA（SP6或T7體外轉(zhuǎn)錄過程中，以Biotin-16-UTP部分取代UTP，從而轉(zhuǎn)錄生成生物素標(biāo)記的RNA探針或mRNA。由于使用的RNA Polymerase對(duì)天然核苷酸(NTP)和生物素標(biāo)記核苷酸(Biotin-NTP)沒有選擇傾向性，因此每個(gè)RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物生物素標(biāo)記的程度可以通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中NTP與Biotin-NTP的比例來(lái)控制。一些試劑盒將Biotin-16-UTP的比例控制在約35%，使反應(yīng)和標(biāo)記效率之間達(dá)到較好的平衡。得到的生物素標(biāo)記的RNA探針或mRNA可使用熒光基團(tuán)、酶或抗體偶聯(lián)的鏈霉親和素(Streptavidin)進(jìn)行檢測(cè)，應(yīng)用與RNA pulldown或其他富集實(shí)驗(yàn)。）逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中使用生物素修飾的引物合成帶有生物素標(biāo)記的cDNA；此外，RNA-seq文庫(kù)構(gòu)建中，生物素標(biāo)記的Oligo(dT)與mRNA3''端的poly A退火形成雜交體，然后用帶有鏈霉親和素的順磁磁珠洗滌并捕獲雜交體，形成雜交體－磁珠復(fù)合體，最后用磁架將此復(fù)合體捕獲；

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    7. 生物素化抗體

    在做western blot或免疫組化時(shí)常使用一抗二抗來(lái)放大、顯示抗原，用酶或熒光標(biāo)記二抗。生物素化的抗體，是在抗體上連接生物素（biotin），生物素能和親和素（avitin）特異性高親和性結(jié)合，親和力是抗原抗體結(jié)合的一萬(wàn)倍，而且一個(gè)avidin可以結(jié)合四個(gè)biotin，這樣又起到級(jí)聯(lián)放大的作用。所以能更加靈敏的顯示微量抗原，這種方法也稱親和免疫組化。目前抗體蛋白標(biāo)記技術(shù)已被廣泛用于醫(yī)學(xué)病理學(xué)、免疫組織化學(xué)、分子生物學(xué)、生物制藥等領(lǐng)域的分析研究與技術(shù)測(cè)定，常見的抗體標(biāo)記技術(shù)包括生物素化標(biāo)記法，酶標(biāo)記法，熒光素標(biāo)記法和膠體金標(biāo)記法。生物素化抗體標(biāo)記的樣品可應(yīng)用酶標(biāo)或熒光染料標(biāo)記的親和素或生物素-親和素復(fù)合物來(lái)檢測(cè)。生物素-SP是其6原子間隔位于生物素和其共軛的蛋白質(zhì)之間。當(dāng)生物素-SP結(jié)合抗體用于酶免疫測(cè)定時(shí)，與沒有間隔的生物素結(jié)合抗體相比，靈敏度會(huì)提高。當(dāng)生物素-SP共軛抗體與堿性磷酸酶共軛鏈維定一起使用時(shí)，這一點(diǎn)尤為明顯。顯然，長(zhǎng)間隔將生物素部分從抗體表面延伸出去，使其更容易接觸到鏈霉親和素的結(jié)合位點(diǎn)。

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                                     生物素-SP分子。分子量454.54 Da。左22.4 ?。

    圖2. 標(biāo)記鏈酶親和素生物素法（LSAB）。A. 一抗體檢測(cè)靶抗原。B. 生物素化二抗可識(shí)別一抗。C. HRP偶連鏈酶親和素與生物素化的二抗體結(jié)合，與HRP偶聯(lián)的二抗相比，能夠顯著增強(qiáng)信號(hào)。

    8. 如何從鏈霉親和素磁珠上解離生物素化分子?

    鏈霉親和素-生物素相互作用是已知的蛋白與其他分子間非共價(jià)的生物相互作用。生物素與鏈霉親和素間的鍵形成非常迅速，一旦形成，就不會(huì)受到pH、溫度、有機(jī)溶劑和其他變性劑等多種因素的影響。從鏈霉親和素上分離生物素時(shí)，如果實(shí)驗(yàn)中使用的是生物素的衍生物或經(jīng)修飾的鏈霉親和素，那么需要特定形式和通常溫和的方法解離，除此之外通常情況下都需要非常劇烈的方法解離，并且會(huì)使鏈霉親和素變性。下面探討了其中兩種方法。

    生物素化核酸：為了從Dynabeads鏈霉親和素磁珠上分離生物素化核酸，在pH 8.2的95%甲酰胺+10 mM EDTA中孵育磁珠，65°C孵育5分鐘或90°C孵育2分鐘。使用磁力架將磁珠吸到試管壁上，將含有生物素化核酸的上清液從試管中取出。有研究提到，在高溫(120C，15分鐘)下，才能在鹽溶液中解離。另外，在6 mol/L鹽酸胍溶液(pH 1.5)中也可解離；有研究指出，生物素標(biāo)記的核酸探針不能用酚抽提，否則生物素核酸會(huì)進(jìn)入酚層而損失；Holmberg等（Electrophoresis 26, 501-510, 2005）報(bào)道稱，在用離子水短時(shí)間孵育后，可將生物素化DNA從鏈霉親合素磁珠上釋放（未進(jìn)行測(cè)試）。

    生物素化蛋白質(zhì)：對(duì)于生物素化蛋白質(zhì)，則可在0.1% SDS或SDS-PAGE緩沖液中煮沸磁珠3分鐘。

    9. 鏈霉親和素磁珠結(jié)合片段的長(zhǎng)度和結(jié)合能力為多少?

    由于具有空間位阻，因此結(jié)合能力取決于片段大小。例如，500 bp片段在Dynabeads M-280鏈霉親和素磁珠上的結(jié)合量是1,000 bp片段的2倍。長(zhǎng)DNA片段會(huì)占據(jù)磁珠周圍更多空間，使其更難“找到"磁珠上的鏈霉親和素。較短的片段更易接近鏈霉親和素。對(duì)于大于2kb的DNA片段，推薦使用Dynabeads kilobaseBINDER™試劑盒。該試劑盒包括Dynabeads M-280鏈霉親和素磁珠和一種可增強(qiáng)長(zhǎng)生物素化DNA片段（大于2kb）固定的結(jié)合液。對(duì)于大于1-2kb的DNA片段，推薦使用Dynabeads kilobaseBINDER™試劑盒，因?yàn)榻Y(jié)合液可增強(qiáng)結(jié)合能力。該結(jié)合液可使DNA線性化，進(jìn)而伸展且堿基堆疊成剛性結(jié)構(gòu)（不適用于質(zhì)?；颦h(huán)狀核酸等較短的片段）。

    鹽濃度可影響生物素化核酸與Dynabeads鏈霉親和素磁珠的結(jié)合效率。對(duì)于1kb以內(nèi)的生物素化DNA片段，最佳結(jié)合條件為1M NaCl（終濃度），25℃孵育15分鐘；較長(zhǎng)的DNA片段應(yīng)固定過夜。生物素化抗體應(yīng)在含0.1% BSA，pH 7.4的PBS緩沖液中固定。由于游離生物素與Dynabeads鏈霉親和素磁珠結(jié)合的速度比大分子更快，因此應(yīng)確保樣本不含過量的游離生物素。應(yīng)使用HPLC或FPLC回收生物素化寡核苷酸，以避免樣本中游離生物素的存在。由于待固定的特定分子的大小和生物素化過程都將影響磁珠的結(jié)合能力，因此，可采用滴定法優(yōu)化每個(gè)單獨(dú)應(yīng)用中的磁珠使用量。

    10. Dynabeads鏈酶親和素磁珠是無(wú)RNase的嗎?

    Dynabeads鏈霉親和素磁珠不是以無(wú)RNase溶液的形式提供的。處理RNA時(shí)，應(yīng)使用DEPC處理的0.1M NaOH/0.05 M NaCl溶液清洗磁珠2次，每次1-3分鐘。DEPC毒性很強(qiáng)。但能去除RNase。清洗后，可使用DEPC處理的0.1 MNaCl溶液重懸磁珠。"DEPC處理"是指：加入0.1% DEPC，混合，室溫下解育1小時(shí)。隨后，將DEPC處理的溶液進(jìn)行高壓滅菌，以破壞DEPC。

    11. 如何去除雙鏈DNA中的非生物素化鏈？

    可通過堿處理或高溫處理分離DNA雙鏈。采取堿處理時(shí)，可使用0.1 M NaOH洗脫非生物素化鏈。通常情況下，該處理方法不會(huì)對(duì)磁珠產(chǎn)生任何影響。在NaOH處理前，在2X結(jié)合和洗滌緩沖液（10 mM Tris-HCl，pH 7.5，1 mM EDTA，2 M NaCl）中清洗Dynabeads/DNA復(fù)合物1次，除去上清液。高鹽濃度將有助于減少電荷，從而使非特異性結(jié)合最小化。向Dynabeads/DNA復(fù)合物中加入新鮮配制（很重要）的0.1 M NaOH溶液，室溫下旋轉(zhuǎn)孵育2-3分鐘（最多5分鐘）。除去含有非生物素化鏈的上清液。再用0.1 M NaOH溶液清洗Dynabeads/DNA復(fù)合物1次，除去上清液。第一次洗脫時(shí)，即可洗脫下大部分DNA。除了堿處理，也可進(jìn)行加熱處理，在水中95°C加熱5分鐘即可。為防止再退火，堿處理或高溫處理后必須快速?gòu)拇胖樯戏蛛xDNA，最好在冰上操作。加熱會(huì)在一定程度（在水中約為7%）上引起生物素化DNA從鏈霉親和素上解離。因此，通常更推薦采用堿處理法。

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