簡(jiǎn)介：

  小鼠肝癌細(xì)胞H22（武漢普諾賽）又稱Hepatoma-22或Hepatoma 22，其分離自Balb/c小鼠腹水，由大連醫(yī)科學(xué)院建立。H22細(xì)胞為懸浮細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)呈淋巴母細(xì)胞樣。H22細(xì)胞常用于小鼠肝癌組織造模，在評(píng)估抗腫瘤藥物的療效、探究腫瘤微環(huán)境對(duì)肝癌進(jìn)展的影響、揭示肝癌發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制等方面的研究中有著廣泛應(yīng)用。

主要耗材及儀器：

 15ml離心管、50ml離心管、凍存管、巴氏滴管、培養(yǎng)瓶、封口膜、CO2培養(yǎng)箱、離心機(jī)、顯微鏡、生物安全柜、RPIM-1640、胎牛血清（FBS）、青-鏈霉素（雙抗）、二甲基亞砜（DMSO）等等。

培養(yǎng)流程：

 1. 細(xì)胞復(fù)蘇

1)用酒精棉球擦拭生物安全柜臺(tái)面，準(zhǔn)備好所需耗材，紫外30min，與此同時(shí)打開37℃恒溫水浴箱對(duì)所用試劑進(jìn)行溫浴，同時(shí)也為復(fù)蘇細(xì)胞做準(zhǔn)備；

2)按照RPIM-1640+10%FBS+1% P/S的比例配制（血清）細(xì)胞培養(yǎng)基，吹打混勻后按10倍細(xì)胞的體積（嚴(yán)格來講是10倍細(xì)胞的體積，實(shí)際操作中適當(dāng)減少用量對(duì)細(xì)胞并無影響）分裝至15ml離心管中（最好依據(jù)所要復(fù)蘇細(xì)胞的量提前計(jì)算要配制的完培用量及所用離心管的數(shù)目）；

3)從液氮拿出H22細(xì)胞，在37℃恒溫水浴箱中快速晃動(dòng)使其溶解（“快溶"），并將其轉(zhuǎn)移至提前分裝有完培的離心管中，吹打混勻；

4)1200rpm，離心3min；

5)棄去廢液，重新加入新的完培，重懸細(xì)胞后將其加入培養(yǎng)瓶中（完培的用量視培養(yǎng)瓶大小而定，25cm²用量3-5ml；75cm²用量10-15ml）;

6)蓋上培養(yǎng)瓶蓋子，以劃“十字"的方式晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，以使細(xì)胞分布均勻，鏡下觀察細(xì)胞均勻分布，置于37℃，5%-10% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，完成細(xì)胞復(fù)蘇。

2. 細(xì)胞傳代

1)鏡下觀察細(xì)胞的生長情況，待細(xì)胞生長至80%以上時(shí)即可進(jìn)行傳代；

2)收集培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞至15min離心管中，1200rpm，離心3min，棄去上清；

3)等待離心的過程中，取出T25培養(yǎng)瓶（此時(shí)培養(yǎng)瓶數(shù)應(yīng)為之前培養(yǎng)瓶數(shù)的兩倍哦），做好標(biāo)記，并分別加入4ml（血清）細(xì)胞培養(yǎng)基；

4)離心結(jié)束后棄去上清，向細(xì)胞沉淀中加入2ml完培，輕輕吹打重懸細(xì)胞，混勻后各取1ml細(xì)胞懸液分別加入新培養(yǎng)瓶中，蓋上蓋子，混勻置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)即可完成H22細(xì)胞傳代。

3. 細(xì)胞凍存

1)從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)瓶，轉(zhuǎn)移細(xì)胞至15ml離心管中，1200rpm，離心3min；

2)等待離心的過程中，按照55% RPIM-1640+40% FBS+5% DMSO的比例配制凍存液；

3)離心結(jié)束后，棄去上清，向離心管中加入凍存液（凍存液用量視分裝的管數(shù)而定），重懸細(xì)胞，分裝于凍存管中，做好標(biāo)記并封口；

4)將凍存管放入程序降溫盒中（“慢凍"），置于-80℃冰箱中，第二天即可拿出細(xì)胞置于液氮罐中保存。

四、注意事項(xiàng)

1．一定要有無菌意識(shí)，以防細(xì)胞被污染，實(shí)驗(yàn)者雙手及所有物品在進(jìn)入生物安全柜和培養(yǎng)箱前均應(yīng)用75%乙醇進(jìn)行表面消毒；

2．復(fù)蘇細(xì)胞時(shí)，不可讓水浴鍋的水位沒過凍存管管口，凍存管中僅剩一小塊冰塊時(shí)即可從水浴鍋中拿出，用其余溫使其融化；

3．生物安全柜在使用前后要用75%乙醇擦拭消毒，并紫外30min；

4．重懸細(xì)胞時(shí)動(dòng)作一定要輕柔，以防對(duì)細(xì)胞造成機(jī)械性損傷；

5．操作過程中手部不要從培養(yǎng)瓶瓶口、離心管管口等部位經(jīng)過；

6．生物安全柜最好嚴(yán)格按照清潔區(qū)-半污染區(qū)-污染區(qū)進(jìn)行分區(qū)，以免造成污染。

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