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    DNA 復(fù)制需要哪些元素

    發(fā)布時間： 2023-06-28　　點擊次數(shù)： 980次
    1) 需要脫氧核苷三磷酸：
    進(jìn)行 DNA 合成必須具備的 2 個關(guān)鍵底物之一，即 4 種脫氧核苷三磷酸——dGTP、dCTP、dATP、dTTP。通常商品化 PCR 酶會提供這 4 種脫氧核苷三磷酸的混合物 dNTP。 
    2) 需要引物-模板接頭：
    DNA 合成的第二個重要底物是一具有特定序列的雙鏈 DNA，稱為引物-模板接頭，即指 導(dǎo)互補脫氧核苷酸添加的單鏈 DNA 模板和與模板互補但比模板短的一小段序列。
    較長的 DNA 鏈有一個與引物退火的區(qū)域和一個毗鄰的單鏈 DNA 區(qū)，此區(qū)作為 DNA 合成的模板；較短的引物與較長的 DNA 鏈退火，且必須有與模板單鏈 DNA 區(qū)毗鄰的游離 的 3’-OH，當(dāng)新核苷酸加入時引物的 3’-OH 端得以延伸。一般而言，引物-模板接頭的引物部分才是 DNA 合成的底物，而模板僅僅提供選擇哪種核苷酸進(jìn)行添加的必要信息。
    因此我們在設(shè)置 PCR 反應(yīng)程序時第一步是高溫變性（一般會設(shè)置成 95℃變性），就是為了把雙鏈的模板變性成單鏈，第二步是降低溫度，是為了讓引物能互補匹配到單鏈模板上。

    3) 需要 DNA 聚合酶：
    DNA 聚合酶的三維結(jié)構(gòu)類似于一只右手。手掌域是催化活性位點，可以催化任意 4 種脫氧核苷三磷酸的添加，這一區(qū)域結(jié)合 2 個二價金屬離子（通常是 Mg2+或 Zn2+）。其中一個 金屬離子降低 3’-OH 對其氫的親和力，這會產(chǎn)生一個準(zhǔn)備對引入 dNTP 上的 α-磷酸進(jìn)行親核 攻擊的 3’O-。第二個金屬離子與 dNTP 的 β-和 γ-磷酸負(fù)電荷協(xié)同作用，穩(wěn)定由引物和引入核苷酸連接在一起時所產(chǎn)生的焦磷酸。所以我們在 PCR 時，反應(yīng)體系里加入適量的 Mg2+是十分重要的，添加的量少導(dǎo)致 PCR 酶無法發(fā)揮最大活性，添加太多則降低酶反應(yīng)的特異性。
     
    DNA 聚合酶是一種延伸酶，其催化是快速的。DNA 合成的速度主要取決于 DNA 聚合酶 的延伸能力。在實際應(yīng)用中，一般的Taq酶的延伸速度大致是擴(kuò)增產(chǎn)物在2kb以內(nèi)是1kb/min。 擴(kuò)增產(chǎn)物超過2kb 的部分可以以500bp/min 來計算。比如擴(kuò)增2kb，延伸時間就設(shè)置成2min， 而擴(kuò)增 3kb，就可以把延伸時間設(shè)置成 4min。也有延伸能力更強的酶，那么延伸時間就按產(chǎn) 品說明書描述的來設(shè)置。


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