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    小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)原代培養(yǎng)

    發(fā)布時間: 2023-01-11  點擊次數(shù): 804次

    原理

    將小鼠的胚胎成纖維細胞(MEF)從機體中取出,經(jīng)胰酶、螯合劑(常用EDTA)處理,分散成單細胞,置MEF生長培養(yǎng)基中培養(yǎng),使細胞得以生存、生長和繁殖。

    材料與儀器

    孕鼠
    PBS EDTA 胰酶 MEF生長培養(yǎng)基 FBS 高糖DMEM
    眼科直剪 眼科直鑷 眼科彎鑷 玻璃平皿3 尼龍濾網(wǎng) 離心管 手術(shù)刀片

    步驟

    一、實驗材料準備

    1.   動物
     
    孕期14至16天的孕鼠(小鼠)。
     
    2.   試劑
    無Ca2+和Mg2+的PBS(D-PBS)、0.05%胰酶、0.53 mmol/L EDTA溶液、MEF生長培養(yǎng)基(高糖DMEM加10%FBS)。
     
    3.  器械
     
    眼科直剪3把、眼科直鑷3把、眼科彎鑷2把、玻璃平皿3套、200目尼龍濾網(wǎng)、50 ml和15 ml離心管和手術(shù)刀片。以上物品均需要高壓滅菌消毒處理。

    二、具體操作

    1.  處死孕鼠,全身置于75%酒精里浸泡,然后在超凈臺中用剪刀和鑷子將孕鼠皮膚剪開,用另外一組剪刀、鑷子剪開腹部肌層,露出子宮,最后用第三組剪刀和鑷子將子宮小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中,沖洗去血。
     
    2.  用兩把彎鑷子將胚胎外的胞膜小心去除,然后夾掉頭和內(nèi)臟,將其余胚胎轉(zhuǎn)移到一個裝有30 ml D-PBS的50 ml離心管中,輕輕顛倒兩次,倒掉D-PBS,再重復(fù)此步驟一次,注意要留少許D-PBS,然后將胚胎轉(zhuǎn)移到另一裝有D-PBS的平皿中,并用手術(shù)刀片將其細細切碎。
     
    3.  用200 ul的移液槍反復(fù)、快速地吹打平皿中的液體,轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中,于4℃ 1500 rpm離心5分鐘,倒掉上清,以10 ml胰酶重懸沉淀,放在37℃水浴中消化30分鐘,且每隔五分鐘輕輕晃動,使之充分消化。
     
    4.   將上層細胞懸液倒入一個裝有10 ml MEF生長培養(yǎng)基的50 ml離心管中,用200目的尼龍網(wǎng)過濾后,以1 500 rpm離心5分鐘收集細胞,再用30 ml MEF生長培養(yǎng)基洗滌兩次。
     
    5.  細胞沉淀用15 ml MEF生長培養(yǎng)基重懸后進行細胞計數(shù)(一般8只14天的胎鼠可獲得2-3x107細胞)。
     
    6.   3x106細胞懸浮于15 ml MEF生長培養(yǎng)基中,接種到200 ml培養(yǎng)瓶中。
     
    7.  24小時后更換新鮮的MEF生長培養(yǎng)基。
     
    8.  細胞長滿后,先用D-PBS沖洗,倒掉后加胰酶消化(此步時間不宜過長,作者一般不超過五分鐘),按1:5傳代。
     
    9.  細胞再次長到覆蓋率80-90%左右,將其消化后,常規(guī)凍存(凍存液要現(xiàn)配)。
     

    小鼠胚胎成纖維細胞(MEF 100倍)

    注意事項

    1.   原代培養(yǎng),一定要避免污染。
     
    2.   MEF生存能力有限,如果不凍存,體外存活十代左右。
     
    3.  凍存后復(fù)蘇的細胞只能傳代一次,因為這些細胞繁殖能力有限。
     
    4.  消化細胞時間不要過長。


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