怎么使用GSIS方法檢測(cè)細(xì)胞胰島素分泌

Min6細(xì)胞是這次贈(zèng)送活動(dòng)中很多客戶(hù)選擇的細(xì)胞，一共送出去有50多株，隨之而來(lái)的就是問(wèn)胰島素的檢測(cè)，很多客戶(hù)檢測(cè)出來(lái)只有低表達(dá)。

Min6細(xì)胞培養(yǎng)需要注意三點(diǎn)：

1.細(xì)胞易聚團(tuán)，消化的時(shí)間表面上看會(huì)非常短暫，大約30秒會(huì)全部脫落，脫落后請(qǐng)延長(zhǎng)消化時(shí)間到2分鐘后，再中和，細(xì)胞后期聚團(tuán)會(huì)減少。

2.活細(xì)胞運(yùn)輸?shù)臅r(shí)候會(huì)漂浮，請(qǐng)收集培養(yǎng)基離心，離心后重新鋪板以完-全培養(yǎng)基剛沒(méi)過(guò)細(xì)胞為準(zhǔn)，完-全培養(yǎng)基加太多會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞浮力過(guò)大，貼壁不上。

3.培養(yǎng)基請(qǐng)一定要加0.05mm的β-Mer

以下是我們檢測(cè)使用的buffer和protocol，步驟不能少，一步一步的來(lái)。

Buffer的配制：

NaCl 114mM, KCl 4.7mM, KH2PO4 1.2mM, MgSO4-7H2O 1.16mM, NaHCO3 25.5mM, CaCl2 2.5mM, HEPES 20mM, 0.2% BSA --> pH 7.2-7.5（一定要控制PH值范圍）

操作步驟：以2mM glucose 和25mM glucose 為例:

細(xì)胞鋪板每孔大約2000個(gè)細(xì)胞，鋪板前三天左右脫抗生素采用滅活血清+β-Mer培養(yǎng)1640+10%FBS(滅活）+0.05mm β-Mer；在96孔板中培養(yǎng)24小時(shí)，然后將培養(yǎng)基改為含2mM葡萄糖培養(yǎng)基過(guò)夜。

1.去除培養(yǎng)基，1 x PBS清洗細(xì)胞5分鐘

2.基礎(chǔ)緩沖液(2mM 葡萄糖) ，2小時(shí)孵育 -- > 培養(yǎng)

3.去除上清液 -- > 1 x pbs 清洗，請(qǐng)注意不要觸碰底面

4.葡萄糖刺激(2mM ) ，1小時(shí)孵育

5.收獲上清液 -- > 1 x pbs 清洗，請(qǐng)注意不要觸碰底面

6.葡萄糖刺激(2mM ) ，1小時(shí)孵育；

7.收獲上清液 -- > 1 x pbs 清洗，請(qǐng)注意不要觸碰底面

8.上清液取樣 -- > 1500轉(zhuǎn)，5 min，4度；

9.細(xì)胞裂解---- > 蛋白質(zhì)定量---- > 上機(jī)

以下為檢測(cè)結(jié)果：

注意點(diǎn)：

為了確保細(xì)胞分泌的胰島素混合到上清液樣本中，可以在培養(yǎng)期間在100-300轉(zhuǎn)的平板振蕩器上輕輕攪動(dòng)細(xì)胞。

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