原代細胞培養(yǎng)

原理

鼠胚原代培養(yǎng)是原代培養(yǎng)一個類型，是指從孕鼠中剖取適宜胎齡的胎鼠，從特定組織中分離出細胞，在適宜條件下增殖培養(yǎng)，直到它們占據(jù)所有可用的基質(zhì)（即達到匯合狀態(tài)）的培養(yǎng)階段。在此階段，必須通過將細胞轉(zhuǎn)移到含有新鮮生長培養(yǎng)基的新容器中進行繼代培養(yǎng)（即傳代），以為其提供更多的繼續(xù)生長空間。

用途

1、藥物篩選實驗；
2、信號通路與機制研究；
3、生物制品的生產(chǎn)(如制備單克隆抗體）等 

材料與儀器

【儀器設(shè)備】超凈工作臺、濾器、CO2 培養(yǎng)箱、電熱干燥箱

【器械及器皿】培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、滴管、鑷子、手術(shù)剪

【試劑】:常用培養(yǎng)基還有：DMEM-高糖、DMEM-低糖、DMEM/F12、RPM1640、MEM、M-199等，可根據(jù)培養(yǎng)需求合理選擇。

血清:一般常用為胎牛血清，人血清和其它動物血清。

平衡鹽溶液:主要用于作為稀釋和灌注的液體,維持細胞滲透壓，提供緩沖系統(tǒng)，使培養(yǎng)液的酸堿度維持在培養(yǎng)細胞生理范圍內(nèi)，提供細胞正常代謝所需的水分和無機離子等。常用的有PBS，Hank's 等。

抗生素:常用為青霉素和鏈霉素。

其它添加成分:緩沖系統(tǒng)，常用為HEPES，在 20 度時為 7.55；37 度為7.31; HEPES 不是起維持 PH 恒定的作用，而是起恒定和抵抗快速 PH 變化的，所以調(diào)整 PH 常常用 NaHCO3 溶液。

有機補充物,如丙酮酸鈉，谷氨酰胺等。促細胞分裂因子，如生長因子類的 FGF、EDF。貼璧和鋪展因子，如膠原蛋白，纖粘蛋白等。

懷孕的母鼠、多聚賴氨酸、0.25% 胰酶、70-75% 酒精溶液

步驟

1、胚鼠原代培養(yǎng)：

1.1 實驗前，超凈工作臺或生物安全柜紫外燈提前照射 30 分鐘；

1.2 取材:取懷孕母鼠，頸椎脫臼法處死后，整個鼠體浸入盛有純酒精的燒杯中浸泡 1 分鐘。取出母鼠在不銹鋼手術(shù)盤中用無菌手術(shù)剪打開腹腔，取出鼠胚，放入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)。注意取材可在無菌操作臺外操作。

1.3 用 70-75% 酒精擦拭裝有鼠胚的培養(yǎng)皿外周后，將培養(yǎng)皿移至超凈工作臺或生物安全柜中，用含雙抗 Hanks 液洗滌鼠胚數(shù)遍卻除血污。在體視顯微鏡下進行操作，用無菌手術(shù)器械去除多余組織，用解剖鑷剖取需要的組織，移入含解離液或培養(yǎng)基的 50 ml 離心管中，用眼科剪將組織剪碎成1立方毫米的肉糜狀；

1.4 在含組織的 50 ml 離心管中加入解離液或培養(yǎng)基至 10 ml。首先用 10 ml彎頭滴管對組織進行吹打 5-10 次，然后用 1 ml 槍頭的吹打組織，最后用 200 μl 的尖的一端進行吹打；

1.5 將上述組織懸液通過 70 μm 過濾器過濾切碎和分散的組織懸浮液，然后 l200 rpm， 4℃ 離 10 分鐘；

1.6 棄掉上清，加入配置好的細胞培養(yǎng)基重懸細胞，接種于經(jīng)多聚賴氨酸預(yù)處理的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中，將其置于于 37℃、5% CO2 培養(yǎng)箱中，三天后換液，以后每兩天換細胞培養(yǎng)液；

2、傳代培養(yǎng)

2.1 實驗前，超凈工作臺或生物安全柜紫外燈提前照射 30 min，開始實驗時，酒精擦拭消毒雙手；

2.2 將原代培養(yǎng)的培養(yǎng)瓶倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，確定細胞是否需要傳代培養(yǎng)；

2.3 用酒精棉球擦凈操作臺，點燃酒精燈，將培養(yǎng)瓶口灼燒消毒；

2.4 倒掉培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，留下貼壁生長的細胞；

2.5 在培養(yǎng)瓶中加入適量 0.25 % 胰酶至剛好漫過貼壁生長的細胞即可，擰上瓶蓋，將培養(yǎng)瓶置于37℃的培養(yǎng)箱中 5 min。在此期間，如果在顯微鏡下觀察可以看到細胞收回突起變成圓形。

2.6 取出培養(yǎng)瓶,輕輕搖晃培養(yǎng)瓶或吹打使細胞脫離瓶壁，將細胞懸液移至離心管中，4℃、800 rpm離心 5 min；

2.7 棄掉離心管中的上清，加入細胞培養(yǎng)基重懸細胞植于多聚賴氨酸預(yù)處理的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板，再將其置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，此時細胞可以繼續(xù)分裂而傳代。

注意事項

1、原代培養(yǎng)注意事項：

1）原代培養(yǎng)要重點注意無菌操作，所用器械需提前高壓滅菌；

2）因為鼠胚原代培養(yǎng)時，獲取組織較少，建議在冷光源體視顯微鏡下操作；

3）原代細胞培養(yǎng)過程比較慢,培養(yǎng)時間最少需要一周以上的時間。若 2 天后可能會出現(xiàn)培養(yǎng)基變黃的現(xiàn)象,且無漂浮物,排除污染，屬于正常現(xiàn)象,這是因為細胞在貼壁生長過程中釋放了CO2 和其他物質(zhì)導致培養(yǎng)液 PH 發(fā)生了改變,所以變黃；

4）正常貼壁細胞在培養(yǎng)幾天后,會逐漸貼滿整個瓶底或者皿底,呈現(xiàn)出相應(yīng)的形狀,有的呈纖維狀,有的星多邊形；

5）細胞的第一次傳代,一定要密度高一些傳代原代細胞傳代密度低,很難長起來。建議 1:2-13傳代如果細胞數(shù)量夠的條件下,P2-P3 代完成實驗是最合適的。如果細胞數(shù)量不夠,那細胞的提取和培養(yǎng)比較重要,盡可能地讓細胞的好狀態(tài)多維持幾代對實驗成敗來說至關(guān)重要；

6）原代細胞不建議凍存,因為凍存很容易復(fù)活不成功。如果要凍存的話,建議在 P2或P3 代凍存,一些比較難復(fù)蘇的細胞可以適當提高凍存液中的血清濃度；

7）很多原代細胞的體外培養(yǎng)需要加入生長因子,細胞才能正常的生長增殖和分化；

2、細胞傳代注意事項：

1）細胞離心時離心速度建議800-1000 rpm/min，4℃ 離心 5 分鐘，避免轉(zhuǎn)數(shù)過高，造成細胞破碎死亡；

2）消化時，注意觀察，切勿消化過度；

常見問題

1、當在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)時發(fā)現(xiàn)，多數(shù)細胞已經(jīng)失去分裂能力了，而好的細胞應(yīng)該呈現(xiàn)長梭形，立體感強。因此，這些細胞不能用于傳代細胞的培養(yǎng)。

2、理論上，在顯微鏡下可以觀察到梭形的細胞說明傳代培養(yǎng)成功。和原代培養(yǎng)的觀察類似。但是總的來說，我們實驗室的實驗結(jié)果不是很好，觀察到的好的細胞很少。其原因可能和原代培養(yǎng)時候的相近。

3.對于不能進行傳代培養(yǎng)的細胞我們進行了活性的觀察實驗。

用臺盼藍染液染色，取 9 滴細胞液加 1 滴臺盼藍，染色不超過 3 分鐘，在顯微鏡下觀察可以發(fā)現(xiàn)，有的細胞核被染成藍色，而有的細胞核沒有著色。

這是因為細胞核被染色的細胞是死細胞，而未被染色的則是活細胞,通過這個實驗可以計算視野中細胞的存活率。

4、細胞增殖分化緩慢：有些原代細胞體外培養(yǎng)需要加入生長因子，細胞才可正常增殖和分化，因而，實驗前要根據(jù)具體細胞配置相應(yīng)培養(yǎng)基；

5、細胞污染：細胞污染類型分為：物理污染、化學污染以及生物污染，因而原代培養(yǎng)要嚴格無菌操作，培養(yǎng)基專用專配不要交叉使用；

6、消化時，細胞長時間難以消化下來：胰酶使用前，需要在 37℃ 水浴鍋充分預(yù)熱，已達到最佳酶活性；