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    誘導(dǎo)與檢測方法

    發(fā)布時間： 2022-02-28　　點擊次數(shù)： 1129次

    同學(xué)A：


    使用細(xì)胞細(xì)胞包被液包被細(xì)胞培養(yǎng)板，將傳代或復(fù)蘇凍存的人間充質(zhì)干細(xì)胞接種到6孔板上，密度為2×105 -3×105 cells/cm2或2×105 -3×105 cells/孔，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%-90%時，小心的將孔內(nèi)間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基吸掉，向6孔板中加入2mL人間充質(zhì)干細(xì)胞脂肪分化培養(yǎng)基（此套裝包含基礎(chǔ)500ml，脂肪細(xì)胞分化因子：5ml,干細(xì)胞生長維持因子：5ml,胎牛血清：25ml ),以此記為第0天。



    一、細(xì)胞誘導(dǎo)前可使用多聚賴氨酸溶液進(jìn)行細(xì)胞包被，以便細(xì)胞更好的進(jìn)行貼壁。



    二、每隔1-2天更換新鮮的人間充質(zhì)干細(xì)胞脂肪分化培養(yǎng)基；

    注意：為防止脂肪細(xì)胞脫落，建議誘導(dǎo)過程中出現(xiàn)大量脂肪細(xì)胞結(jié)節(jié)之后，換液形式變?yōu)槊刻煲淮伟肓繐Q液。


    三、 誘導(dǎo)14-21天期間，視細(xì)胞的形態(tài)變化及生長情況進(jìn)行染色。


    ? 





    以下是總結(jié)的染色方法     

    脂肪油紅染色，有的是動物/人體脂肪組織切片，或細(xì)胞爬片。各有操作稍有差異。


    一

    *成熟飽滿的脂肪細(xì)胞，容易破裂，脂滴泄漏，所以壓片，切片都要考慮到這個問題。 


    二

    細(xì)胞爬片細(xì)胞溶液脫落，特別是脂滴大的。操作務(wù)必要輕柔。不要把細(xì)胞沖掉。


    三

    如果做脂肪組織冰凍切片，冰凍切片要適當(dāng)厚一些，一般為10-15µm，切片太薄容易導(dǎo)致脂肪流失


    四

    如果培養(yǎng)載體為塑料制品，hoechst33342染核的話，塑料板自發(fā)熒光也為藍(lán)色，必須考慮波長，激發(fā)波長/發(fā)射波長=485nm/572nm



    誘導(dǎo)的小鼠MMSC-BM的成脂肪細(xì)胞

    五

    染色步驟：

    （1） 先小心輕緩倒去培養(yǎng)液。 
    （2） 用pbs輕緩漂洗。
    （3）加10%中性甲醛或者95%以上的酒精固定30min以上
    （4） 稀釋改良型即用油紅染色試劑盒，油紅：PBS＝3:2，室溫放置10min
    （5）染色10-20min左右，加的體積覆蓋住板底即可，如6孔加1.5ml，24孔加0.5-1ml。
    （6）脫色，用75%酒精/60%異丙醇漂洗，除去多余的染料

    （7） 復(fù)染，淡蘇木染色1/5分鐘，pbs漂洗（這一步不做也可，看試驗需要，并且蘇木素會把胞漿染紅，如要顯示核， hoechst33342也可以，濃度5微克/毫升染10分鐘即可把核染上）。
    （8）甘油明膠封片（封片后可長期保存）。

    （9） 若不用明膠封片，請盡快拍照。


    同學(xué)B：

    油紅O染色試劑盒在傳代培養(yǎng)中，接種密度是影響體外培養(yǎng)間質(zhì)干細(xì)胞增殖潛能的重要因素。低密度接種時，間質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力明顯提高，而誘導(dǎo)細(xì)胞分化時則需要較高的細(xì)胞密度，這可能與分化時細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用有關(guān)。而在培養(yǎng)過程中，若細(xì)胞過度融合會促進(jìn)其分化趨向，故要保持干細(xì)胞未分化狀態(tài)，要及時傳代。


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