流式細(xì)胞術(shù)的空白對(duì)照、同型對(duì)照、FMO對(duì)照要怎么選？

流式數(shù)據(jù)分析時(shí)，應(yīng)該把門設(shè)在哪里合適呢，特別是那些分群不明顯的結(jié)果。

我們知道流式細(xì)胞術(shù)常見的有空白對(duì)照（未染色細(xì)胞）、同型對(duì)照和FMO對(duì)照，每種對(duì)照適用于什么情況呢？

1、空白對(duì)照：空白對(duì)照的作用是作為電壓調(diào)節(jié)的參考，調(diào)整電壓參數(shù)使細(xì)胞信號(hào)在圖上各個(gè)通道的合適位置。同時(shí)，也是可以看到細(xì)胞的本底信號(hào)，圈門時(shí)直接排除。

未處理的細(xì)胞，不能作為處理組細(xì)胞的圈門依據(jù)，需要使用相同處理組的空白對(duì)照，來觀察細(xì)胞的本底信號(hào)。

空白對(duì)照適用于細(xì)胞分群明顯、背景熒光弱、已有大量研究的分群明確的細(xì)胞群圈門，例如CD3、CD4、CD8等等。

2、同型對(duì)照（isotype）：同型對(duì)照的作用是排除背景熒光，使用同型對(duì)照可以更準(zhǔn)確地排除假陽性。

例如，以下這張圖，黑色線的是空白對(duì)照，黃色是同型對(duì)照，紅色是實(shí)驗(yàn)組染色細(xì)胞，可以看出同型對(duì)照和空白對(duì)照會(huì)有所差別，會(huì)有少量的非特異性染色。

當(dāng)非特異性染色比較強(qiáng)時(shí)，如果繼續(xù)用空白對(duì)照作為圈門依據(jù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果就不能準(zhǔn)確反映真實(shí)情況了。

一般抗體說明書都會(huì)有同型對(duì)照和抗體染色的驗(yàn)證圖，我們?cè)谶x擇抗體時(shí)盡量選擇陽性峰與同型對(duì)照峰分得比較開的，通常抗體公司也會(huì)有此抗體對(duì)應(yīng)的同型對(duì)照出售。

3、FMO對(duì)照：FMO對(duì)照也叫做熒光扣除對(duì)照/抗體減一對(duì)照（Fluorescence-Minus-One Control），是指在多色染色分析時(shí)，對(duì)其中某一個(gè)通道設(shè)置的陰性對(duì)照，也就是不染目標(biāo)通道的顏色，其他指標(biāo)都染色。多在研究不同細(xì)胞亞群表達(dá)某些重要的表型分子、細(xì)胞因子等時(shí)應(yīng)用。

FMO對(duì)照有兩個(gè)作用：

（1）多色分析時(shí)，有些通道的信號(hào)不好區(qū)分，可能存在某個(gè)熒光對(duì)該通道干擾很大，可以使用FMO對(duì)照來找到這個(gè)熒光。

（2）作為我們需要重點(diǎn)分析的某個(gè)指標(biāo)的陰性對(duì)照，可以排除全染的背景影響，有助于更準(zhǔn)確地圈門。

對(duì)于一些分群不明顯，或表達(dá)量不高的指標(biāo)，使用FMO對(duì)照作為圈門依據(jù)會(huì)比空白對(duì)照更合適。

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