細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)如何對(duì)器皿進(jìn)行表面處理？

    科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)，在缺乏血清條件下，克隆細(xì)胞必須以濃度為1mg/ml的多聚賴氨酸包被培養(yǎng)皿，同樣的技術(shù)也可以促進(jìn)神經(jīng)突觸的生長(zhǎng)。其中，多聚-D-賴氨酸（PDL）異構(gòu)體優(yōu)于多聚-L-賴氨酸（PLL），因?yàn)榍罢卟蝗菀妆患?xì)胞外液蛋白酶水解，但目前兩者都在使用。

    Poly-L-lysine的中文名為多聚賴氨酸，簡(jiǎn)稱PLL，是通過鏈霉菌屬的細(xì)菌菌株自然發(fā)酵生產(chǎn)聚賴氨酸。

貼壁依賴性細(xì)胞，通過包被帶正電的高分子多聚賴氨酸，可以提高無(wú)血清或低血清培養(yǎng)環(huán)境下的細(xì)胞貼壁率，加強(qiáng)培養(yǎng)器皿表面對(duì)血清蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的吸附，加快細(xì)胞的增殖。

    多聚賴氨酸（ScienCell，貨號(hào)：0403/0413）包被多適用于神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)，能夠促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞分化和神經(jīng)突的生長(zhǎng)。

    膠原（collagen）是哺乳動(dòng)物體內(nèi)含量最多的一類蛋白質(zhì)，廣泛存在于從低等脊椎動(dòng)物的體表面到哺乳動(dòng)物機(jī)體的一切組織中。它是支持細(xì)胞和組織生長(zhǎng)的重要胞外基質(zhì)蛋白，其形成的胞外環(huán)境有利于多種細(xì)胞的粘附、生長(zhǎng)、遷移和分化。用變性膠原處理后能改善多種細(xì)胞的附著能力，如上皮細(xì)胞；而天然未變性的膠原可能是細(xì)胞分化功能表達(dá)所必需的。

    明膠是一種大分子非均質(zhì)親水膠體，是膠原部分水解后得到的水溶性蛋白多聚體，明膠與膠原具有同源性。實(shí)驗(yàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，包被明膠有利于肌肉細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)。

    明膠溶液（ScienCell，貨號(hào)：0423）與多聚賴氨酸一樣，也是一種粘附劑，涂覆在容器表面可以促進(jìn)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。推薦用于培養(yǎng)分化的人類胚胎干細(xì)胞、某些原代細(xì)胞和永生化細(xì)胞。

    明膠因其具有較高的生物相容性、生物可降解性且體內(nèi)降解后不產(chǎn)生其他副產(chǎn)物、無(wú)免疫原性和血液相容性以及具有與膠原相同的組分和生物性質(zhì)，也廣泛應(yīng)用于組織工程和藥物遞送系統(tǒng)中。

    基質(zhì)成分包括層粘連蛋白、纖連蛋白、玻連蛋白等，其中許多是天然產(chǎn)物，如果化學(xué)成分不*明確，則需要一定的純化。當(dāng)然，細(xì)胞外基質(zhì)中的許多成分都可以作為重組蛋白使用，因此成分明確，可以純化。

    纖連蛋白（Fibronectin, FN），也稱為纖維連接蛋白，是一種廣譜的、天然的細(xì)胞粘附因子。它主要由肝臟及血管內(nèi)皮細(xì)胞生成，廣泛存在于血漿、多種細(xì)胞表面及細(xì)胞基質(zhì)中，一種高分子量的非膠原性糖蛋白，分子含糖量4.5－9.5％可以與血纖蛋白、肝素、膠原、DNA以及細(xì)胞表面受體結(jié)合，而且具有多種細(xì)胞生物學(xué)功能，廣泛參與細(xì)胞的遷移、粘附、增殖、止血及組織修復(fù)的過程。

    常用于細(xì)胞培養(yǎng)的纖連蛋白一般為牛血漿纖維粘連蛋白（ScienCell，貨號(hào)：8248）或人纖連蛋白（ScienCell，貨號(hào)：8488；中喬新舟，貨號(hào)：CSP044）。

    纖連蛋白作為細(xì)胞培養(yǎng)的基質(zhì)，可提高多種細(xì)胞的貼壁率、匯合率，縮短細(xì)胞匯合時(shí)間，使細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)良好，代謝率增強(qiáng)，DNA、RNA及蛋白質(zhì)合成速度顯著提高；細(xì)胞的集落率升高，原代培養(yǎng)成活率提高。

    雖然表面有惰性包被已經(jīng)足夠了，但仍然有必要利用合適的單層細(xì)胞培養(yǎng)物為某些特殊細(xì)胞類型提供合適基質(zhì)。如用去污劑去除匯合的小鼠成纖維細(xì)胞（3T3）、人成纖維細(xì)胞（MRC-5）等的單層細(xì)胞后，殘留的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）能促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞的分化、研究腫瘤細(xì)胞行為及血管形態(tài)發(fā)生。

    基質(zhì)覆蓋有助于細(xì)胞的附著、生長(zhǎng)和分化。但對(duì)于一些較難培養(yǎng)的細(xì)胞，尤其是低細(xì)胞密度下更難培養(yǎng)的細(xì)胞，需要活細(xì)胞來維持。原因可能是成纖維細(xì)胞的代謝物滲漏，或是成纖維細(xì)胞分泌生長(zhǎng)因子對(duì)培養(yǎng)基的補(bǔ)充，也可能由于細(xì)胞產(chǎn)物優(yōu)化了細(xì)胞的附著面。生長(zhǎng)成匯合單層細(xì)胞的飼養(yǎng)層可為其他細(xì)胞附著提供一個(gè)合適的甚至是選擇性的表面。例如，單層神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞可以促進(jìn)中樞和外周神經(jīng)元的存活及生長(zhǎng)，雖然這種情況是由擴(kuò)散因子而不是直接的細(xì)胞接觸引起的。

    飼養(yǎng)層細(xì)胞大部分可用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF），而飼養(yǎng)層細(xì)胞大都用于培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞。

    當(dāng)然，有時(shí)我們不希望細(xì)胞附著生長(zhǎng)，例如培養(yǎng)非貼壁依賴性的細(xì)胞（懸浮細(xì)胞）時(shí)，可通過將細(xì)胞接種到瓊脂中的方法來實(shí)現(xiàn)，因?yàn)樵谶@些基質(zhì)中未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞不易形成集落。目前最為常用到的是瓊脂、瓊脂糖或Methocel（甲基纖維素）。前兩種為凝膠，第三種為高粘度溶膠。因?yàn)榧谆w維素是溶膠，細(xì)胞可以在其中緩慢下沉，因此經(jīng)常在其下面放一層瓊脂。在非組織培養(yǎng)基的器皿上不涂瓊脂層也能達(dá)到細(xì)胞培養(yǎng)的目的，但有時(shí)會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞附著和鋪展。