哺乳動物細(xì)胞抽提物中熒光素酶的測定實驗

材料與儀器

DNA 轉(zhuǎn)染的哺乳動物培養(yǎng)細(xì)胞
細(xì)胞裂解緩沖液 熒光素酶測定緩沖液 熒光素溶液 不含鈣鹽和鎂鹽的磷酸鹽緩沖液
熒光光度計和光度計測置管 橡膠棒

步驟

1. 轉(zhuǎn)染后 24-72 h, 室溫下用不含鈣鹽和鎂鹽的磷酸鹽緩沖液（PBS） 洗細(xì)胞 3 次。PBS 換液時要輕緩，因為有些哺乳動物細(xì)胞（如人胎腎 293 細(xì)胞）在劇烈吹打時很容易從培養(yǎng)皿上脫落下來。通常，熒光素酶基因在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中獲得最大表達量的時間是 24-72 h。

2. 每個 100 mm 培養(yǎng)皿中的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，加入 lml 冰冷的裂解緩沖液。緩沖液輕輕旋轉(zhuǎn)， 然后用橡膠棒把裂解細(xì)胞從培養(yǎng)皿上刮下來。細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)移到 1.5 ml 離心管中。

3. 細(xì)胞裂解物在 4°C 以最大速度離心 5 min。把上清小心地轉(zhuǎn)移到另一個新的 1.5 ml 離心管中。

4. 用 Bradford 測定等快速比色法確定裂解物的蛋白濃度。在測定蛋白濃度前，為了防止干擾，把 TritonX-100 的濃度稀釋到小于等于 0.1%。這步中，細(xì)胞裂解液可以分成小份， 貯存在-70°C。雖然貯存在或-20°C 時，熒光素酶在裂解緩沖液中不穩(wěn)定（Brasier et al.1989）， 但是在含 15%（V/V）甘油和 1%（m/V） 牛血淸白蛋白的緩沖液中，該酶可以在 4°C 安全貯存。

5. 敲打盛有裂解物的管子的管壁，輕輕使裂解物混合。室溫下，在每個含有 360ul 熒光素酶測定緩沖液的熒光光度計管中加入 5-200ul 細(xì)胞裂解液。管子放入熒光光度計。

除了可使用熒光光度計測量熒光素酶活性，還有另一種方法在欄目替代方案：用閃爍計數(shù)器測量熒光素酶活性。

6. 測定開始，200ul 熒光素溶液加到熒光光度計管中，然后在室溫測量 2-60s 時間內(nèi)的光輸出。測光輸出時間的最佳長短要根據(jù)經(jīng)驗確定，而且與轉(zhuǎn)染細(xì)胞的類型以及所用的特殊底物和熒光素酶有關(guān)。

7. 測定每個管子產(chǎn)生的相對光單位數(shù)，并確定測量的線性范圍。使用適當(dāng)量的細(xì)胞裂解蛋白，使它在隨后測量中產(chǎn)生的值位于線性范圍的中部。根據(jù)所研究啟動子的強度以及每次實驗的轉(zhuǎn)染效率，所需蛋白的量會有變化。細(xì)胞裂解物中熒光素酶活性可以用相對光單位數(shù)或毫克表示。

注意事項

熒光素是能夠受熒光素酶催化發(fā)光的底物的通稱。常用的熒光素酶基因來自螢火蟲，它作用于特定的熒光素底物。其他如來自海三色堇或某種海洋細(xì)菌的熒光素酶所使用的熒光素底物具有不同的化學(xué)性質(zhì)。確定前面緩沖液中所用的熒光素底物確實與表達質(zhì)粒中的熒光素酶基因相匹配。

常見問題

為了減少內(nèi)在的變化因素，比如：培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)目、細(xì)胞轉(zhuǎn)染和裂解的效率等對實驗準(zhǔn)確性的影響，將帶有熒光素酶基因的質(zhì)粒作為對照質(zhì)粒與報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，提供轉(zhuǎn)錄效率的內(nèi)對照，使測試結(jié)果不受實驗條件變化的干擾。在測量過程中，首先加入熒光素酶檢測試劑時產(chǎn)生螢火蟲熒光信號，這樣先測量螢火蟲熒光素酶活性。定量螢火蟲熒光強度之后，再在同一樣品中加入Stop&Glo Reagent試劑，將上述反應(yīng)淬滅，并同時啟動海腎熒光素酶反應(yīng)，進行第二次測量，稱之為雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灐?br style="border: 0px solid; box-sizing: border-box; --tw-shadow:0 0 #0000; max-width: 100%; background-image: none !important; background-position: initial !important; background-size: initial !important; background-repeat: initial !important; background-attachment: initial !important; background-origin: initial !important; background-clip: initial !important; color: rgb(77, 88, 101) !important; font-size: 0.32rem !important; line-height: 0.5rem !important; margin: 0px !important;"/>