解答流式細胞凋亡檢測疑難

1、Q：rh Annexin V R-PE 20 tests是BD公司用于凋亡流式檢測的試劑盒，產(chǎn)品顯示種屬為人，請問能否用于大鼠細胞的檢測？

A：可以。因為Annexin V是與PS親和，而PS在不同種屬間應該沒差異。在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V是一種分子量為35~36kD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結(jié)合。因此Annexin V被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。將Annexin V進行熒光素（FITC）標記，以標記了的Annexin V作為熒光探針，利用熒光顯微鏡或流式細胞儀可檢測細胞凋亡的發(fā)生。

2、Q：用流式作細胞凋亡為什么跟tunel差別那么大??？？tunel測出來的細胞凋亡率大概有30%而作流式測出來的凋亡率只有2%（陰性對照0.5%）差別好大啊，用的是beckman公司的Annexin V /PI雙染試劑盒，實驗步驟如下：

（1）胰酶消化貼壁細胞，加培養(yǎng)基中止，離心1000轉(zhuǎn)5min

（2）吸去上清，PBS0.5ml 重懸細胞（因為要送到別處作流式，期間路程約1h，戶外溫度約37度）

（3）然后加入Annexin V /PI各5微升，避光20min，上機。

請問這是什么原因?qū)е碌模?/p>

A：我也用這兩種方法做過凋亡，是存在兩種方法測的凋亡率差別有點大，但還沒有大到你這樣的程度。雙染測的是凋亡的早期事件PS外翻。TUNEL測的是凋亡最晚期的事件DNA的片段化。而且TUNEL在檢測過程中，把操作損傷細胞和壞死細胞當作了凋亡細胞，而且如果TUNEL是肉眼計數(shù)的話，也會有判斷上的誤差，所以，往往TUNEL作出來的凋亡率高一點。但如果凋亡率達到30%，ladder估計也應該跑的出來。雙染雖然是機器操作，但在調(diào)試補償時，人為的影響還是挺明顯的，也不是特別的客觀。基線稍微左移，你的凋亡率就成倍上升。所以，給你的建議是在經(jīng)費、時間允許的范圍內(nèi)再多做幾次吧。感覺這么大的差異，可能這兩種方法都會存在問題。還有，去流式的路上，裝細胞的ep管最好插在冰上，拿著冰盒。

3、Q：可以用液氮保存瘤組織塊，然后再做流式細胞分析嗎？

A：我認為是不能的。因為流式細胞分析要求細胞分散、單個，活性好，這樣才能區(qū)分死亡、凋亡和活性細胞。組織在凍存、復溫的過程中會有大量的細胞死亡，同時經(jīng)過這一過程的組織在分離成單個細胞的時候會形成許多細胞碎片，不宜上流式檢測了，所以用于流式檢測的標本最好是新鮮標本，即取材后立即檢測，效果最（女子）。

我以前也試圖將組織存入-80℃，然后進行流式檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)后來處理的組織細胞不是粘團就是破碎，根本無法檢測。如果你實在找不到可以檢測的流式細胞儀，我建議你可以將組織標本進行切片，然后做原位染色，觀察組織細胞的凋亡。

我們實驗室的腫瘤組織塊一部分凍存于液氮用于以后提蛋白做Western或提RNA做RT-PCR，另一部分用10%的甲醛固定用于以后做免疫組化。

4、Q：有關(guān)流式前收集細胞的問題1、貼壁細胞做流式前用胰酶消化下來對細胞膜損傷小還是用細胞刮刮下來損傷?。糠N在板里的貼壁細胞可以先染PI然后再消化下來嗎？這樣是否可以減小由于消化液造成的細胞膜破損而染上的PI的誤差？

A：我想做NK細胞對腫瘤細胞的殺傷實驗，用MTT做了很多回，但只有NK細胞的對照組OD值就和腫瘤對照組差不多高了，這樣NK細胞殺傷腫瘤細胞后自身的變化對抑制率的影響會很大，所以想用流式來測腫瘤細胞的凋亡。我擔心胰酶消化會造成細胞膜的損傷，這樣就會有一些細胞因消化的原因染上PI，所以想嘗試先染PI，洗掉多余的PI后再用胰酶把細胞消化下來，不知道可不可以。低濃度胰酶消化，輕柔吹打貼壁細胞2～3次，吊桶式離心機4度1000rpm 3～5min離心，處理得當?shù)脑?，胰酶造成損傷可以控制在5%以內(nèi)，有對照組的情況下對實驗結(jié)果不會造成明顯影響。而先加PI不僅染色是否每組都均勻充分很難判斷，而且PI本身對細胞也是有毒性的，對你的實驗結(jié)果影響會比胰酶大，個人不建議這樣做。

5、Q：做流式細胞過程中，由于不能用胰酶消化貼壁細胞，還有其他什么方法嗎？由于293細胞貼壁能力很強，現(xiàn)在要做流式，要把貼在培養(yǎng)皿壁上的細胞消化下來。但又不能用胰酶消化，我試著用1毫升的1mM的EDTA消化20min，結(jié)果細胞很難消化下來。最后，去做流式檢測結(jié)果很差。不知道還有其他什么更好的消化方法，但又不破壞細胞膜的表面結(jié)構(gòu)。

A：不是不能用胰酶消化是不能用含有EDTA的胰酶消化，因為annexinV是Ca依賴的蛋白，所以不能加入EDTA， 防止EDTA螯合了Ca離子從而影響annexinV，進而影響結(jié)果。所以你可以用不含EDTA的胰酶，放入溫箱內(nèi)進行消化，時間可以長一點，隨時觀察細胞情況，避免消化過度。建議用細胞刮子把細胞刮下來，然后用槍吹勻，比消化還簡單，而且也避免了胰酶帶來的損傷，機械的損傷還是很小的因為細胞大多呈大片大片地被刮下來。

6、Q：流式測凋亡為何左上象限出奇的高？

A：看了你的數(shù)據(jù)，我覺得第一跟你的細胞狀態(tài)很有關(guān)系，你說對照組中間也有很多死細胞，而且你做實驗時也吸上來了，壞死的細胞和凋亡的細胞是不一樣的，如果細胞壞死破裂很多的話這時左上象限PI就很高了，再則，PI染的時間5-10分鐘就可以了。我做的時候是采用PI和Annexin V分開染，PI先染或離心去掉染液，然后再加結(jié)合液和Annexin V10分鐘后上機檢測。PBS洗的目的有利于Annexin V的結(jié)合反應，為了縮短實驗時間和較少細胞損失，我一般也就洗一次。最后，我個人的觀點是做實驗時，細胞狀態(tài)一定要好的情況下去做，不要勉強，這一既浪費試劑和時間，也往往得不到好的可靠的結(jié)果。你做的是貼壁細胞，中間有好多死的細胞，你可以先接種細胞，待細胞貼壁好了，然后再換一次液，這樣就把那些死細胞去掉，接下來再加藥物。

7、Q：請教做流式細胞儀檢測細胞凋亡，那種方法比較好？也比較經(jīng)濟實惠？Annexin V/PI雙染色法和Hoechst/PI雙染法哪種更好一點？

A：Hoechst/PI染色在流式分析中并不常見。Hoechst需要紫外激發(fā)，因此只有在配備了相應激發(fā)光源的流式細胞儀上才能使用。我的印象中，不少地方的分選用流式為了用Hoechst分析sp表型的干細胞，配備了此激發(fā)光源，但是普通的分析用流式，多半是沒有配備的。

8、Q：流式細胞儀檢測凋亡如何算是否有統(tǒng)計學意義？

A：用流式檢測凋亡時，PI受時間的影響很大，因標記了PI后會加大細胞毒性，隨著時間延長會導致PI的染色增加，特別是檢測早期凋亡時，如果時間延長除了會導致在流式細胞儀上的細胞分群差距加大外，誤差會明顯加大。一般的說明書都會標明，PI在上機前5分鐘加，然后在一個小時內(nèi)檢測。根據(jù)以前做流式凋亡時的經(jīng)驗，我個人認為，一般每組實驗一次可以先做三個復孔，上機前5分鐘加PI，最好在半小時內(nèi)檢測完畢。這時可以先分析下三個復孔的差異。等待摸索的實驗條件成熟后，每組實驗一次可以做6~8個復孔，然后做統(tǒng)計學分析。嚴格說來，當做出統(tǒng)計學差異時，這樣的實驗還要重復三次。但是因檢測凋亡時，受細胞狀態(tài)，PI染色時間，流式檢測時間，以及每次實驗時的誤差等的影響外，很難保證能夠*重復出上次的結(jié)果，甚至即使在保證了實驗條件幾乎相同的情況下，每次重復的差異也會出現(xiàn)加大的情況。這時可以適當重復2~3次，盡量使差異減小。

9、Q：如何用Hoechst33342/PI流式檢測凋亡？

A：標記完以后，若用流式檢測，壞死細胞與凋亡細胞的峰形是不一樣的，壞死細胞呈反拋物線，而凋亡細胞呈正常，應是雙曲線吧，很容易區(qū)分的。關(guān)于PI與Hoechst33342作用：PI、Hoechst33342均可與細胞核DNA（或RNA）結(jié)合。但是PI不能通過正常的細胞膜，Hoechst則為膜通透性的熒光染料，故細胞在處于壞死或晚期調(diào)亡時細胞膜被破壞，這時可為PI著紅色。正常細胞和中早期調(diào)亡細胞均可被Hoechst著色，但是正常細胞核的Hoechst著色的形態(tài)呈圓形，淡蘭色，內(nèi)有較深的蘭色顆粒；而調(diào)亡細胞的核由于濃集而呈亮蘭色，或核呈分葉，碎片狀，邊集。故PI著色為壞死細胞；亮蘭色，或核呈分葉狀，邊集的Hoechst著色的為調(diào)亡細胞。

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