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    細(xì)胞培養(yǎng)常見問(wèn)題及解答(二)

    發(fā)布時(shí)間: 2021-12-09  點(diǎn)擊次數(shù): 1440次

    接上一期,本期我們繼續(xù)分享細(xì)胞培養(yǎng)常見的問(wèn)題吧~


    12. 附著性細(xì)胞繼代時(shí)所使用的trypsin-EDTA 濃度?應(yīng)如何處理?

    一般使用的trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53 mM EDTA Na4。 第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中,保存于-20 ℃,避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin 的活性降低,并可減少污染的機(jī)會(huì)。

     



    13. 欲將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來(lái),其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速?

    回收動(dòng)物細(xì)胞,其離心速率一般為300xg (約1 000 rpm),5-10 分鐘,過(guò)高的轉(zhuǎn)速,將造成細(xì)胞死亡。

     



    14. 細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基的成份為何?

    動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存時(shí)最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5-10% DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90-95% 原來(lái)細(xì)胞生長(zhǎng)用的新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意:由于DMSO 稀釋時(shí)會(huì)放出大量熱能,故不可將DMSO 直接加入細(xì)胞液中,必須使用前先行配制完成。

     



    15. DMSO 的等級(jí)和無(wú)菌過(guò)濾的方式為何?

    冷凍保存使用的DMSO 等級(jí),必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650),其本身即為無(wú)菌狀況,第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中,保存于4℃,避免反復(fù)冷凍解凍造成DMSO 的裂解而釋出有害物質(zhì),并可減少污染的機(jī)會(huì)。若要過(guò)濾DMSO,則須使用耐DMSO 的Nylon 材質(zhì)濾膜。

     



    16. 冷凍保存細(xì)胞的方法?

    冷凍保存方法一:冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ (-20℃ 30 分鐘*) → -80℃16~18 小時(shí)(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

    冷凍保存方法二:冷凍管置于已設(shè)定程序的可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3 ℃至-80℃以下,再放入液氮槽vapor phase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。*-20℃不可超過(guò)1 小時(shí),以防止冰晶過(guò)大,造成細(xì)胞大量死亡,亦可跳過(guò)此步驟,接放入-80℃冰箱中,惟存活率稍微 降低一些。

     



    17. 細(xì)胞欲冷凍保存時(shí), 細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度?

    冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1x106 cells/ml vial,融合瘤細(xì)胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。 

     



    18.培養(yǎng)基中是否須添加抗生素? 

    除于特殊篩選系統(tǒng)中外,一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下,培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。

     



    19. 應(yīng)如何避免細(xì)胞污染?

    細(xì)胞污染的種類可分成細(xì)菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因?yàn)闊o(wú)菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染的血清和污染的細(xì)胞等。嚴(yán)格的無(wú)菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好的細(xì)胞來(lái)源和培養(yǎng)基配制是減低污染的最好方法。當(dāng)然,適當(dāng)添加抗生素也是防止細(xì)胞污染的途徑。


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