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    大鼠肝星狀細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

    發(fā)布時(shí)間： 2021-12-06　　點(diǎn)擊次數(shù)： 836次

    材料與儀器

    雄性 SD 大鼠
    戊巴（匕匕）妥鈉 小牛血清 DMEM 酶消化液I、Ⅱ Nycodenz D-Hanks’液 HBSS 臺(tái)盼蘭
    手術(shù)器械 尼龍網(wǎng) 相差顯微鏡 熒光顯微鏡

    步驟


    一、實(shí)驗(yàn)步驟
     

    1. 大鼠腹腔麻醉后在超凈臺(tái)上剖腹，進(jìn)行門靜脈插管。
     
    2. 以D-Hanks‘液灌注，同時(shí)剪開(kāi)下腔靜脈，沖掉血液后，改灌以100 ml 酶消化液I(0.05% IV 型膠原酶)。
     
    3. 待肝臟變軟后，離體肝臟并剪碎，繼續(xù)以酶消化液II(含20U/ml DNase I 的0.05% IV 型膠原酶)消化15 min，尼龍網(wǎng)過(guò)濾后以450 g 離心5 min(4℃，下同)。
     
    4. 以HBSS 重懸沉淀至10 ml，再混以20 ml Nycodenz 液，分置于離心管中，并分別覆以2-3 ml HBSS，1450 g 離心16 min 后取界面細(xì)胞。
     
    5. 以HBSS重懸后再次離心收集細(xì)胞，以DMEM重懸后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并判斷存活率和產(chǎn)量，最后按照常規(guī)方法接種(105 細(xì)胞/cm2 )，次日換液，以后每2-3 天換液一次。
     
    6. 傳代方法：棄去培液后以D-Hanks’液洗兩次，加0.125%胰酶(原代最好加0.05% EDTA)消化，鏡下觀察細(xì)胞突起回縮(2-5 min左右)，以*培液(DMEM+10% NBS)終止反應(yīng)(若不用EDTA，可以不需離心)， 充分吹打后以 1:2-1:3 接種，然后繼續(xù)培養(yǎng)(5% CO2，37℃)。


    二、結(jié)果

    接種次日，光鏡下可見(jiàn)細(xì)胞呈星芒狀，胞質(zhì)內(nèi)有脂滴，熒光鏡下328  nm 處見(jiàn)自發(fā)熒光。附照片(圖 1)。

     

    圖 1. 原代培養(yǎng)第 2 天的大鼠肝星狀細(xì)胞


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