核提取物的制備方法

步驟

1a) 收集轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的細(xì)胞：將 5× 108?10× 108 細(xì)胞置 1 L 的塑料瓶 1850 g 離心 20 min。輕輕倒去上清并丟棄，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入50 mL 錐形刻度離心管中（每管 2?3 L 培養(yǎng)液中的細(xì)胞）。進(jìn)行步驟 2。

1b) 收集單層培養(yǎng)的細(xì)胞：?jiǎn)螌蛹?xì)胞長(zhǎng)滿后去掉培養(yǎng)液。用足量 PBS 洗 1 次，PBS 用 量為沒(méi)過(guò)細(xì)胞，輕輕振蕩，棄 PBS。將細(xì)胞刮入新鮮 PBS 液里，倒進(jìn)錐形刻度離心管中。進(jìn)行步驟 2。

2) 1850 g 離心 10 min。進(jìn)行步驟 3a 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)或步驟 3b 單層培養(yǎng)。

3a) 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細(xì)胞：輕輕倒出上清并棄掉。用離心管上的刻度測(cè)量壓緊后細(xì)胞的體積 (Pcv)將細(xì)胞重懸于約 5 倍于其 pcv 的 PBS 液中。1850 g 離心10 min。進(jìn)行步 驟 4。

3b) 單層培養(yǎng)細(xì)胞：輕輕倒出上清并棄掉。用離心管上的刻度測(cè)量 pcv, 進(jìn)行步驟 4。

4) 快速地將沉淀的細(xì)胞重懸于 5 倍體積的低滲緩沖液中1850 g 離心 10 min 并棄掉上 清。

5) 將細(xì)胞沉淀重懸于 3 倍于原 pcv 的低滲緩沖液中，放置在冰上 10 min，讓細(xì)胞腫脹。

6) 將細(xì)胞轉(zhuǎn)到 Dmmce 氏玻璃勻漿器中，用 B 號(hào)研杵上下抽提 10 次。用臺(tái)盼藍(lán)染色排斥法在顯微鏡下檢査細(xì)胞裂解情況（應(yīng)大于80%?90%)。

7) 將細(xì)胞轉(zhuǎn)到離心管中。用 JS4.2 轉(zhuǎn)子 3300 g 離心 15 min 收集細(xì)胞核。保留上清用來(lái)制備 S-l00 細(xì)胞質(zhì)提取物。

8) 用離心管上的刻度測(cè)量第 7 步離心壓緊后的細(xì)胞核體積（pnv)。用 l/2 pnv 體積的低鹽緩沖液重懸細(xì)胞核。

9) 在輕輕攪拌的同時(shí)，逐滴加入1/2 pnv 體積（見(jiàn)步驟 8) 的高鹽緩沖液。必要時(shí)用 Dounce 氏玻璃勻裝器混勻。

10) 不斷輕輕攪拌 30 min 以提取核內(nèi)容物。

11) 用 Beckman JA-20 轉(zhuǎn)子 25 000 g 離心 30 min 以收集核提取物。倒出上清并測(cè)量其電導(dǎo)率（見(jiàn)步驟 12)，這就是核提取物。

12) 將核提取物加入透析管中，用夾子至少封住透析袋的一端；透析袋一端是打開(kāi)的， 這樣就可以測(cè)量透析袋內(nèi)核提取物的電導(dǎo)率，比較核提取物電導(dǎo)率和透析液電導(dǎo)率 的不同，以確定是否需要進(jìn)一步透析。在 50 倍體積的透析液中進(jìn)行透析，直到提 取物的電導(dǎo)率和透析液一致為止（即提取物的 KCr 濃度達(dá)到 100 mmol/L 時(shí)）。盡量縮短透析時(shí)間。

取 5?10 μl 提取物用水稀釋至 1 mL 用來(lái)測(cè)電導(dǎo)。用電導(dǎo)測(cè)量?jī)x直接讀出稀釋液的電導(dǎo)值，與同樣稀釋的透析液的電導(dǎo)值相比較。

13) 將提取物從透析袋中移出，最后一次檢測(cè)其電導(dǎo)率以確定透析已經(jīng)完成。將提取物25000 g 離心 20 min, 棄掉沉淀。

14) 測(cè)定上清中蛋白質(zhì)濃度。根據(jù)需要分裝，浸入液氮中速凍，-80℃保存。