分離培養(yǎng)細胞的操作步驟

一、材料

無菌 

1. 轉(zhuǎn)運培養(yǎng)液：Ham F12（Seromed 08101），不含 NaHCO3，含有 20 mmol/LHEPES(Serva 25245),75 ml

2. 生長培養(yǎng)液: Ham F12, 添加 20%FBS（Gibco 011-06290），200 ml 

3. 鏈霉菌蛋白酶液：0.15% 鏈霉菌蛋白酶（Sigma P-6911）、0.03% EDTA（Merck 8418）、20IU/ml 青霉素和 20ug/ml 鏈霉素（0.4%Eurobio PES300），用 Ham F12 或 D-PBSA 配制 100 ml 

4. D-PBSA：100 ml

5. 尼龍網(wǎng)：孔徑為 100um

6. 手術(shù)刀 

7. 鋒利的長剪刀 

8. Petri 培養(yǎng)皿：直徑為 90 mm，用于切組織塊 

9. 培養(yǎng)皿：25 cm2，4 個 

10. 20 ml 離心管或一般容器，5 只 

非滅菌 

1. 血細胞計數(shù)板 

二、操作步驟：

1. 分離：用手術(shù)刀切除活檢組織塊上的非肌性組織，然后用 D-PBSA 浸洗。

2. 稱重前，與肌纖維平行將切除活檢組織切成片，用 D-PBSA 沖洗。

3. 將組織片平行放入 Petri 培養(yǎng)皿蓋內(nèi)，切成較薄的柱狀組織塊，然后切成 1 mm3小塊。不要擠壓組織。也可在試管內(nèi)用長剪刀將組織簡稱小塊，應避免擠壓組織。

4. 用 D-PBSA 浸洗組織塊，靜置后吸取上清液。

5. 在 37℃ 條件下，用鏈霉菌蛋白酶液消化組織塊 1 h。每 1~3 mg 組織塊用 15 ml 鏈霉菌蛋白酶液。每間隔 10~15 min 輕輕搖晃試管。

6. 孵育后用吸管研磨組織塊。由于越來越多的細胞分離下來，培養(yǎng)液會逐漸變得渾濁。

7. 讓組織塊沉到試管的底部，形成沉降的組織塊（P1）和上清液（S1）。

8. 用孔徑為 100um 的尼龍網(wǎng)將 S1 濾入 20 ml 離心管。輕輕搖晃或用吸管吹打上清液，使細胞混懸。

9. 離心（350 g，8~10 min）后，吸取上清液。

10. 準確加入 10 ml 生長培養(yǎng)液，用帶有橡皮吸頭的吸管很輕微地混懸細胞。然后，用血細胞計數(shù)板計數(shù)細胞。

11. 用生長培養(yǎng)液稀釋細胞懸液，以約 1.5x104個/ml 的細胞密度將細胞接種于培養(yǎng)瓶。從 1 g 健康供體活檢組織約獲得 1~2x105 個細胞。

12. 將 15 ml 消化液加入 P1，在 37℃ 水浴中孵育組織塊 30 min，并定時搖晃。

13. 用吸管吹打細胞懸液，使細胞分散。然后，用尼龍網(wǎng)過濾細胞懸液。用 20 ml 生長培養(yǎng)液浸洗濾網(wǎng)。

14. 離心（350 g，8~10 min）后，計數(shù)細胞，按上述方法接種細胞。

15. 將培養(yǎng)瓶移入濕潤的培養(yǎng)箱，在 37℃ 和 5%CO2 的條件下培養(yǎng)細胞，

安全提示
在扔入垃圾前，應該用次氯酸鹽處理剩余組織和使用過的試管、吸管、培養(yǎng)皿。

維持培養(yǎng) 

16. 接種后 24 h 很輕微地換培養(yǎng)液，以后每 3~4d 換液 1 次。細胞主要向著分化生長。人成肌細胞的生長分 3 期，培養(yǎng)后 4~6d 增殖達高峰；8d 作用排列成 行；10~12d 細胞融合形成肌管增多。然而，必須記住一些細胞可能分化較早，絕大多數(shù)細胞分化時一些細胞仍處于增殖狀態(tài)。

傳代培養(yǎng) 

17. 將少量 EDTA 輕輕注在細胞上面后立即吸取。

18. 加入 0.25% 胰蛋白酶液，足以在細胞上面形成一薄層。

19. 當細胞去附著時，加入 5~10 ml *生長培養(yǎng)液，用吸管很輕微地吹打細胞，然后離心（350 g，10 min）。

20. 計數(shù)細胞，按一定密度種植細胞。