做好流式太難？可能方法就用錯了，解決思路看這里!

現(xiàn)已被廣泛用于免疫學(xué)、細胞生物學(xué)、血液學(xué)、腫瘤學(xué)、微生物學(xué)等多個領(lǐng)域。典型的應(yīng)用實例包括血液系統(tǒng)疾病的免疫分型，腫瘤學(xué)中細胞 DNA 的倍體和周期分析，細胞生物學(xué)研究中的細胞凋亡、增殖，細胞表面或胞內(nèi)的抗原檢測等。

其中，流式技術(shù)較為廣泛的應(yīng)用是使用流式抗體進行細胞的分型鑒定，常見的免疫表型分析實驗包括單細胞懸液制備、細胞表面或胞內(nèi)抗體的染色、上機檢測等基本步驟。

直接法：熒光標記的抗體直接與細胞的抗原結(jié)合，一步孵育后即可以進行細胞的流式上機檢測。直接法因為其方便快捷，交叉反應(yīng)和背景少，是目前主流的流式標記手段。

間接法：細胞先與一抗進行孵育，然后熒光二抗再結(jié)合到一抗上形成免疫檢測復(fù)合物，后續(xù)即可以進行上機。當(dāng)商品化的直標抗體無法獲得時，間接法可以作為補充，但間接法在多色實驗中很難避免種屬間的交叉反應(yīng)，選擇性會大大受到影響。

兩種流式細胞標記法原理見圖 1。

圖 1 流式抗體標記常見的兩種形式

（左圖為直接法，右圖為間接法）

除選擇上述兩種商品化標記抗體外，還可使用抗體標記試劑盒標記抗體，獲取實驗所需的熒光標記抗體，但該方法對技術(shù)要求高，標記效果往往受多種因素影響。常見的傳統(tǒng)流式細胞標記方法，見表 1。

表 1 常見的傳統(tǒng)流式細胞標記方法

隨著流式細胞儀、單克隆抗體和熒光探針的不斷發(fā)展，流式分析已經(jīng)從早期的單激光單色檢測，發(fā)展到可快速同時定量檢測一種細胞的多種特性，多色多參數(shù)多激光的檢測分析。

同時分析多個抗原或多種細胞特性的能力為越來越復(fù)雜的實驗打開了新的大門，但多色流式細胞分析需要平衡多個難題的解法，包括儀器配置、抗原表達和染料亮度，以及可用的抗體- 染料組合等，考慮的要素見圖 2。

圖 2 流式多色方案設(shè)計需要考慮的要素

流式的配色需要綜合考慮以下因素：

如果研究人員無法在一次實驗中妥善調(diào)和上述因素，就需要退而求其次，進行多次分析。而多次分析難免引入各不相同的實驗條件，由此造成的數(shù)據(jù)波動最終會導(dǎo)致數(shù)據(jù)結(jié)果不可靠。

ColorWheel^® 流式抗體和染料組合采用專為流式細胞術(shù)優(yōu)化的專（禾刂）技術(shù)，支持用戶分別選擇抗體和染料并根據(jù)自身需要任意組合，在保證實驗成功率的同時又可幫助簡化流式細胞分析流程，突破傳統(tǒng)流式分析方案的局限。

主要優(yōu)勢：

ColorWheel^® 技術(shù)基于專（禾刂）的寡核苷酸配對連接技術(shù)將抗體與染料偶聯(lián)起來（詳見圖 3），偶聯(lián)產(chǎn)物與熒光標記的直標抗體保持一致，可以直接用于流式的標記檢測。該技術(shù)的偶聯(lián)過程只需要簡單的 1:1 的混合，其偶聯(lián)過程比起傳統(tǒng)的抗體標記方法大大簡化。ColorWheel^® 流式抗體的選擇靈活性能讓使用者更加靈活的設(shè)計多色方案，擺脫由于抗體熒光組合缺失導(dǎo)致的配色困境（詳見表 2）。

圖 3  ColorWheel 流式抗體偶聯(lián)技術(shù)示意

表 2 Colorwheel^® 助力突破傳統(tǒng)多色流式分析的局限

應(yīng)用舉例：

ColorWheel^® 不僅可以簡化流式細胞分析流程，突破傳統(tǒng)流式分析方案的局限，同時可以保證在多重指標的流式實驗中具有優(yōu)異的表現(xiàn)。

以下實驗檢測了免疫 T 細胞檢測常用的指標 CD3，CD4，CD44，CD45RA，該 4 重指標的實驗用來評估 CD4+ 輔助型T細胞的激活狀態(tài)。結(jié)果顯示，ColorWheel^® 流式抗體與傳統(tǒng)的流式抗體具有同樣優(yōu)異的表現(xiàn)（詳見圖 4）。

圖 4 ColorWheel 流式抗體與傳統(tǒng)流式抗體的檢測效果比較（左邊是 ColorWheel^® 結(jié)果，右邊是傳統(tǒng)數(shù)據(jù)）