慢病毒載體——構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株的利器

隨著病毒生物學(xué)的發(fā)展，諸多病毒載體已成為了在各種實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行核酸轉(zhuǎn)運(yùn)的重要工具，主流的病毒載體主要包括：慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒。其中，慢病毒的應(yīng)用較為廣泛。

慢病毒的英文是Lentivirus，它的命名有兩層含義。一方面，Lenti-在拉丁文中有慢的意思；另一方面，被慢病毒感染的患者早期很難觀察，大多都會經(jīng)歷一個長達(dá)數(shù)年的潛伏期，之后才緩慢發(fā)病，因此這些病原微生物被稱之為慢病毒。

它是逆轉(zhuǎn)錄病毒科下的一個屬，其主要包括8種能夠感染人和脊椎動物的病毒，原發(fā)感染的細(xì)胞以巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主，最終導(dǎo)致感染個體發(fā)病。其典型特征為其RNA基因組能逆轉(zhuǎn)錄為cDNA副本，cDNA副本又能穩(wěn)定整合至宿主細(xì)胞基因組中（這就是常說的穩(wěn)轉(zhuǎn)）。

慢病毒

慢病毒的基因組都很復(fù)雜，編碼一系列不同于其他逆轉(zhuǎn)錄病毒的調(diào)控蛋白，這使得它們具有*的調(diào)控途徑和病毒持久性機(jī)制。

慢病毒的基因結(jié)構(gòu)

各類慢病毒的基因結(jié)構(gòu)

所有的逆轉(zhuǎn)錄病毒都至少含有這三種基因：gag、pol和env，它們編碼結(jié)構(gòu)蛋白和酶（逆轉(zhuǎn)錄酶，RNase H，整合酶，和蛋白酶），這是病毒復(fù)制所必需的。然而，慢病毒包含額外的基因，這些基因?qū)τ谟行У牟《緩?fù)制和持久性是定不可少的。如原型慢病毒HIV-1，編碼了6個額外的基因（tat、rev、vif、vpu、vpr和nef）。HIV-2和SIV缺乏vpu基因，但包含一個叫做vpx的基因。非靈長類的慢病毒含有較少的這些額外基因，但都包含了tat和rev基因，它們分別負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄激活病毒基因表達(dá)。

HIV-1作為慢病毒的代表，其結(jié)構(gòu)具有一定的特點(diǎn)。它是一個單鏈的RNA病毒，其由9個基因所構(gòu)成，gag、pol、env3個基因編碼病毒的基本結(jié)構(gòu)，tat、rev2個調(diào)節(jié)基因，vif、vpr、vpu、nef 4個輔助基因。gap基因可以編碼病毒所需的核心蛋白；pol基因編碼病毒復(fù)制所需要的酶；env基因編碼病毒的包膜糖蛋白，并且可以決定病毒感染宿主的靶向性。rev基因編碼的蛋白調(diào)節(jié)gag、pol、env的表達(dá)水平，tat編碼的蛋白參與RNA轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)，此外兩端為長末端重復(fù)系列，一般簡稱其為LTR，內(nèi)含復(fù)制所需的順式作用原件。

1. 感染范圍廣

慢病毒可有效感染分裂和非分裂細(xì)胞，適合幾乎所有細(xì)胞系，如神經(jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞等。

2. 可穩(wěn)定表達(dá)

慢病毒可將外源基因整合到宿主細(xì)胞基因組上，不隨著細(xì)胞的分裂傳代而丟失，大大提高目的基因或目的shRNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，能夠方便快捷地實(shí)現(xiàn)基因的長期、穩(wěn)定表達(dá)。

3. 操作安全性高

慢病毒采用的是自失活復(fù)制缺陷型病毒株，保障操作安全。

通常，對慢病毒的利用，更多是通過慢病毒載體來進(jìn)行的。慢病毒載體是以HIV-1(人類免疫缺陷I型病毒)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體，該載體可以將外源基因有效地整合到宿主的染色體上，從而達(dá)到外源基因的持久性表達(dá)。此外，這一載體區(qū)別于一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，即可以將轉(zhuǎn)基因技術(shù)整合到分裂和非分裂細(xì)胞的基因組中。

慢病毒載體包含了包裝、感染、穩(wěn)定整合所需要的全部遺傳信息，是慢病毒載體系統(tǒng)的主要組成部分。攜帶有外源基因的慢病毒載體在慢病毒包裝質(zhì)粒、細(xì)胞系的輔助下，經(jīng)過病毒包裝成為有感染力的病毒顆粒，將其進(jìn)行收集和濃縮后可直接感染宿主細(xì)胞或者動物模型，實(shí)現(xiàn)外源基因在細(xì)胞或活體組織中表達(dá)。

許多研究者在研究基因功能時，會進(jìn)行基因干擾和基因過表達(dá)，讓實(shí)驗(yàn)結(jié)論更嚴(yán)謹(jǐn)。基因過表達(dá)和干擾分別是指通過慢病毒感染細(xì)胞的方式，使目的細(xì)胞過量表達(dá)或沉默某特定基因，從而實(shí)現(xiàn)基因的功能增強(qiáng)或減弱?；蜻^表達(dá)和干擾作為一種傳統(tǒng)的分子生物學(xué)技術(shù)至今依然在生物學(xué)研究中發(fā)揮著重要作用。

我們針對難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，建立了標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)服務(wù)體系，可為您提供過表達(dá)、干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建服務(wù)。結(jié)合高效的慢病毒系統(tǒng)，我們可以準(zhǔn)確地將您的目的基因和示蹤基因插入到目的細(xì)胞基因組中，得到穩(wěn)定表達(dá)或沉默特定基因的細(xì)胞株。

實(shí)驗(yàn)交付材料：

實(shí)驗(yàn)案例：