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    高保真DNA聚合酶究竟有哪些魔力呢?

    發(fā)布時(shí)間: 2021-09-26  點(diǎn)擊次數(shù): 2794次

    作用原理

    高保真DNA聚合酶含有聚合中心和酶切中心[1],聚合中心具有5’-3’聚合酶活性,負(fù)責(zé)聚合作用;酶切中心具有3’-5’外切酶活性(也稱校對(duì)活性),負(fù)責(zé)將不配對(duì)的核苷酸予以切除。

    在PCR擴(kuò)增過(guò)程中,當(dāng)引物與模板*互補(bǔ)后,進(jìn)入聚合中心,在聚合酶活性作用下,游離的脫氧核苷酸通過(guò)互補(bǔ)配對(duì)原則,依次結(jié)合到引物的3’端,新鏈DNA從5’到3’進(jìn)行延伸(圖1-a);當(dāng)引物末端結(jié)合的核苷酸與模板不配對(duì)時(shí)(圖1-b),錯(cuò)配的核苷酸會(huì)翹起,新鏈DNA無(wú)法繼續(xù)向前延伸,進(jìn)而進(jìn)入酶切中心,在外切酶活性作用下,錯(cuò)配的核苷酸會(huì)被切除(圖1-c);切除后此位點(diǎn)會(huì)重新結(jié)合正確的核苷酸,新鏈DNA又能繼續(xù)從5’到3’進(jìn)行延伸(圖1-d),最終使新鏈DNA能夠進(jìn)行精準(zhǔn)復(fù)制[1-2]。

    高保真DNA聚合酶究竟有哪些魔力呢?

    圖1. 高保真DNA聚合酶工作原理示意圖[1-2]


    應(yīng)用方向

    基因功能研究

    案例:研究表明A基因可能參與擬南芥中花青素的代謝,為了驗(yàn)證這一假設(shè),要先將A基因從擬南芥中擴(kuò)增出來(lái),構(gòu)建到過(guò)表達(dá)或抑制表達(dá)載體上,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入擬南芥中,使A基因在擬南芥體內(nèi)過(guò)表達(dá)或抑制表達(dá),最后通過(guò)形態(tài)指標(biāo)、生理指標(biāo)及基因表達(dá)水平等來(lái)判定這一假設(shè)是否成立。


    基因測(cè)序

    案例:若想探究擬南芥中B蛋白家族中不同基因的異同點(diǎn),需要先將B蛋白家族中的所有基因從擬南芥中擴(kuò)增出來(lái),得到這些基因的堿基序列,然后通過(guò)生物信息學(xué)分析來(lái)初步分析它們的異同點(diǎn)。

    以上研究均需借助PCR技術(shù)將目的基因從物種中精準(zhǔn)擴(kuò)增出來(lái),如果擴(kuò)增出的基因序列出現(xiàn)突變,那么后續(xù)分析都會(huì)不準(zhǔn)確;為了保證目的基因的精準(zhǔn)擴(kuò)增,我們?cè)赑CR擴(kuò)增過(guò)程中就需要使用高保真DNA聚合酶。


    此外,高保真DNA聚合酶也可以用于基因型鑒定。

    答疑劇場(chǎng)
    問(wèn)Q1:高保真DNA聚合酶擴(kuò)增產(chǎn)物為平末端,后續(xù)做TA克隆,如何在產(chǎn)物末端加A?

    答:反應(yīng)體系:10 µl

    ①單酶:1 µl 10×Taq Buffer(MgCl2 Plus),0.5 µl dNTP Mix (10 mM),0.2 µl Taq DNA Polymerase,1-7 µl純化后PCR片段,ddH2O補(bǔ)齊至10 µl


    ②Mix:5 μl 2×Taq Master Mix,1-5 µl純化后PCR片段,ddH2O補(bǔ)齊至10 µl
    反應(yīng)程序:72℃,10 min



    問(wèn)Q2:高保真酶DNA聚合酶擴(kuò)增的片段一定不會(huì)突變嗎?

    答:高保真DNA聚合酶具有3’-5’的外切酶活性,在PCR擴(kuò)增過(guò)程中可降低核苷酸錯(cuò)配的概率,保真度越高的DNA聚合酶,核苷酸錯(cuò)配的概率就會(huì)越低,但不表示擴(kuò)增過(guò)程中絕對(duì)不會(huì)發(fā)生核苷酸的錯(cuò)配。因此,為了提高實(shí)驗(yàn)的成功率,建議同一樣本挑取多個(gè)(>3個(gè))單克隆進(jìn)行測(cè)序。



    問(wèn)Q3:不同公司高保真DNA聚合酶的保真度有可比性嗎?

    答:高保真酶的保真度通常表示為是Taq酶的幾倍,常見(jiàn)的保真度測(cè)定方法有:藍(lán)白斑篩選測(cè)定、一代測(cè)序和NGS測(cè)序等。不同品牌DNA聚合酶的保真度測(cè)定方法不同,若想要比較不同品牌DNA聚合酶的保真度,必須采用相同的保真度測(cè)定方法,進(jìn)行平行比對(duì)。


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    參考文獻(xiàn):

    [1] 黎景光. DNA聚合酶高保真原理應(yīng)用于SNP檢測(cè)的研究[D]. 暨南大學(xué), 2006.

    [2] Steitz TA. DNA polymerases: structural diversity and common mechanisms. J Biol Chem, 1999, 274(25): 17395–17398.



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